龙岩市仔猪病毒性腹泻检测与分析

郑新添，吴天兴，戴爱玲，李晓华，杨小燕

（1.龙岩学院生命科学学院，福建 龙岩364012；2.预防兽医学与生物技术福建省高等学校重点实验室，福建 龙岩364012）

腹泻是危害猪场最严重的疾病之一，尤以仔猪 腹泻发病更为严重。腹泻的病因有多种，其中传染病是一个主要因素，引起仔猪腹泻的传染病中，危害最大的是猪传染性胃肠炎（TGE），猪流行性腹泻（PED）及猪轮状病毒（RV）感染等病毒性腹泻。TGE是由猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）引起的一种急性、高度接触性肠道传染病，发病急，传播快，各种年龄的猪都可感染，以引起7～10日龄仔猪呕吐、严重腹泻和高死亡率为特征。PED是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的高度接触性胃肠传染病，以水样腹泻、呕吐、脱水和新生仔猪高度死亡为特征。猪轮状病毒是人畜共患腹泻的重要病原之一，也是仔猪腹泻的重要病因。TGE、PED和RV在临床症状、流行病学和病理变化上无明显差异，目前尚无特效治疗药物，给猪场造成了很大损失[1]。近年来，仔猪这3种病毒性感染发病率呈上升趋势，流行病学规律发生较大变化，如病毒的混合感染日趋增多[2]。为了解龙岩市猪场病毒性感染情况，本文在前期建立多重RT-PCR鉴别诊断TGEV、PEDV以及RV感染的基础上[3]，对龙岩市近两年仔猪的TGE、PED及RV病毒性腹泻进行检测与分析，为该病的预防、控制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 96份病料采集自2012年1月至2013年9月龙岩学院动物医学研究所接诊的45个猪场的腹泻粪便及小肠、淋巴结等组织。

1.1.2主要试剂与引物 TRIZol、RNA反转录酶、DNA Marker DL-2 000等，购自上海生工生物工程技术服务有限公司，其他试剂均为分析纯。3对扩增引物分别是TGEV（tgev-f 5′-CAACCCTGAAACTAACGCAATTCT-3′，tgev-r 5′GCCCATCCAGTCGCACTAC TT-3′）、PEDV（pedv-f 5′-AGGAACGTGACCTYAAA GACATCCC-3′，pedv-r 5′-CCAGGATAAGCCGGTC TAACATTG-3′），RV（RV-f5′-AAATCCGCAACTAT ACTGTGACTA-3′，RV-r 5′-TGGCCAACTGGTTCTGTCTA-3′）引物扩增长度分别为252 bp，540 bp和410 bp，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 核酸提取及逆转录 RNA提取采用TRIZol试剂提取法。称取组织0.2 g（粪样预处理：取0.2 g，加入0.8mLPBS振荡混匀，10 000 r/m离心10min，取200μL上清），加入TRIZol Reagent600μL，室温作用5min后加入200μL氯仿，颠倒混匀。4℃，12 000 r/min离心10min，取上清至新的1.5mL离心管中，加等体积异丙醇，颠倒混匀。12 000 r/min（4℃）离心10min，弃上清，1mL 75%乙醇洗涤。12 000 r/min（4℃）离心10min，自然干燥，用20μLDEPC水溶解。逆转录过程为：在1.5mL离心管中加入：MMuLV 5×Buffer 4μL，Rnase Inhibitor（40 U/μL）0.5 μL，M-MuLV Reverse Transcriptase（5 U/μL）1μL，random primer 1μL，dNTPs（2.5mmol/L）1μL，RNA模板5μL，室温下混匀后，42℃水浴1 h，冰浴2min，10 000 r/min离心30 s，即得cDNA，-20℃保存备用。1.2.2 腹泻病毒PCR检测 用本实验室建立的多重RT-PCR法进行TGEV、PEDV和RV的病原检测[3]。以上述步骤1.2.1中合成的cDNA为模板进行PCR扩增。扩增体系为10×PCR Buffer 2.5μL，dNTPs（2.5mmol/L）1μL，TGEV、PEDV和RV等3对引物各1μL，rTaq（5 U/μL）0.5μL，cDNA模板2μL，ddH2O 16.5μL。95℃预变性5min后，进入95℃60 s，51℃和72℃60 s，共循环35次，最后72℃延伸5min。4℃保存PCR产物。PCR结束后，取5μL产物作琼脂糖凝胶电泳分析。

2 结果

2.1 TGEV、PEDV及RV的检出率 对96份腹泻病料进行TGEV、PEDV和RV病原检测，部分检测结果如图1，结果表明（表1），TGEV、PEDV和RV阳性率分别为25.0%（24/96）、22.9%（22/96）和14.6%（14/96）；TGEV+PEDV、PEDV+RV及TGEV+RV混合感染阳性率分别为5.2%（5/96），7.3%（7/96）和4.2%（4/96），3者混合感染阳性率为2.1%（2/96）。

图1 部分样品PCR检测结果

表1 龙岩市TGEV、PEDV及RV感染情况

2.2 TGEV、PEDV及RV感染的月份分布 对所调查的96份样品，按其送检月份分成12-2月、3-5月、6-8月及9-11月，统计各阶段的感染率（表2），结果表明，TGEV在12-2月份阳性率（45.9%）较高，PEDV在3-5月份阳性率高达32.4%，RV不具有明显的季节性，除12-2月份未发现感染外，其他月份的阳性率相近。

表2 不同月份的阳性率分布

2.3 TGEV、PEDV及RV感染猪的年龄分布 对所调查的96份样品，送检猪按年龄分为1-4周龄和5-12周龄两类，统计两个阶段病毒性腹泻的阳性率，结果表明（表3），1-4周龄共71份样品，TGEV、PEDV和RV的阳性率分别为23.9%，22.5%和14.1%；5-12周龄共25份样品，TGEV、PEDV和RV的阳性率分别为28%，24%和16%。

表3 不同周龄的阳性率分布

3 讨论

TGEV、PEDV及RV是仔猪病毒性腹泻的3种主要病原，3者导致的仔猪病毒性腹泻临床上难以区分，RT-PCR技术可对其进行敏感、特异的鉴别。笔者建立的可同时鉴别此3种病毒的多重RT-PCR技术为本次感染率调查的准确性提供了保证[3]。仔猪的此3种病毒性在不同地区的感染率不同，近两年国内报道的PEDV感染率较高[4-5]，阳性率甚至高达87.9%[6]，此次调查表明，我市的PED感染率相对较低，但阳性场比例仍然较高。96份粪便检测结果表明，TGEV、PEDV及RV阳性率分别为25.0%、22.9%和14.6%，因此笔者认为2012-2013年9月龙岩市以猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎为主，而轮状病毒感染率较低。此3种病毒间常呈单独感染或混合感染，近年来混合感染在我国猪场呈上升趋势[7-8]。此次检测表明，本市猪场TGEV和PEDV混合感染、PEDV和RV混合感染、TGEV和RV混合感染阳性率分别为5.2%（5/95）、7.3%（7/96）和4.2%（4/96），3者混合感染率为2.1%（2/96），其混合感染率与其他报道相近[8]。TGE，PED和RV等仔猪病毒性腹泻多发生于冬春和晚秋季节，近年来，在很多地区和规模化猪场，夏秋季也有猪病毒性腹泻的流行[9]。本文通过对小猪感染月份的统计和分析表明，龙岩市TGEV在12-2月份阳性率高达50%，PEDV在3-5月份阳性率高达32.4%。PEDV在我国以12月至次年2月为高发季节[10]，而此次检测表明，PEDV的季节性有不明显趋势，这与国内对两种疾病的流行报道相近[11]。仔猪腹泻性疾病主要发生在出生后10日龄以内的哺乳仔猪，日龄较大的哺乳仔猪的发病率和病死率相对较低。本文研究表明，日龄较大的5-12周龄仔猪感染率有上升趋势。病毒性腹泻尚无有效治疗药物，疫苗免疫接种是预防猪病毒性腹泻的主要手段，应在制定免疫程序时加强母猪免疫，同时加强猪场中小猪阶段的保温和卫生管理，定期消毒。

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