犬细小病毒山东流行株分离鉴定及其全基因组测序分析

于永乐，宫文妮，杨海燕，赵秀美，张传美，张洪亮，单 虎

（1.青岛农业大学山东省预防兽医学重点实验室，山东 青岛266109；2.无锡出入境检验检疫局，江苏 无锡214101；3.南京农业大学动物医学院，江苏 南京210095）

犬细小病毒（canine parvovirus，CPV）自1978年发现以来，已在全世界多个国家迅速传播和蔓延，是目前公认的引起犬及犬科动物出血性肠炎和心肌炎的重大病原之一。在我国，1982年最早报道了此病的发生，此后的30多年伴随着该病毒的不断进化和变异，给我国养犬业带来越来越大的损失[1]。

CPV是单股、负链、线性DNA病毒，基因组全长5.2 kb，包含两个大开放阅读框ORF1(编码结构蛋白VP1和VP2)和ORF2(编码非结构蛋白NS1和NS2)[2-3]，其中VP2蛋白是主要的衣壳蛋白和病毒保护性抗原蛋白，同时具有自我装配形成病毒样颗粒（VLPS）的能力[4]。NS1蛋白是主要的非结构蛋白，也是一个多功能的基因表达调控蛋白，而且目前研究证实NS1蛋白与CPV致细胞凋亡有关[5]。犬细小病毒最显著的生物学特性就是其VP2基因高的进化速率（2×10-4次/位点·年），已达到某些RNA病毒的进化速率[6-7]。这主要表现在新的抗原变异体的不断出现，从1979-2000年，CPV-2发生了几次重要的基因变异，先后产生了CPV-2a、CPV-2b、New CPV-2a和New CPV-2b、CPV-2c(a)和CPV-2c(b)以及CPV-2c七种抗原变异株[8-9]，每一种抗原变异株的出现都对犬细小病毒进化机制的深入研究产生了深远的影响。本研究通过对山东地区犬细小病毒流行株分离鉴定和全基因组分析，从而确定分离株的来源和遗传变异情况，为山东地区犬细小病毒的遗传进化、流行病学等进一步的研究奠定基础，为疫苗的研制提供新的材料基础。

1 材料与方法

1.1 材料 病毒分离样品来自山东各地区宠物医院发病犬，CPV胶体金抗原检测试纸条检测为CPV阳性，采集粪便，用于病毒分离培养。F81细胞由青岛农业大学山东省预防兽医学重点实验室保存。犬细小病毒参考毒株为犬细小病毒灭活疫苗，购自Intervet公司。

主要试剂有DMEM培养基、胎牛血清，购自美国Gibco公司；DNAiso Reagent、rTaq DNA聚合酶、DNA Marker DL 2 000、pMD 18-TVector、胶回收试剂盒、大肠杆菌DH-5α感受态细胞，均购自宝生物工程(大连)有限公司；其余所使用试剂均为分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 病毒增殖与分离 取患病犬的粪便，按1∶9的比例加入灭菌的PBS，研磨离心取上清液，按1∶9的比例加入氯仿，混匀离心取上部水层加入青霉素和链霉素，滤膜过滤除菌，-70℃保存备用。采取同步接毒法，每10mL细胞营养液中加入病料上清500μL，试验过程中设对照。培养接毒细胞和对照细胞，观察有无病变产生。待80%细胞产生细胞病变（CPE）时，收获病毒。

1.2.2 引物设计与合成 根据GenBank登录的犬细小病毒VP2基因序列，利用软件设计了一对特异性检测引物，预期扩增片段大小为685 bp；P1：5'-GAAGAGTGGTTGTAAATAATTTGG-3'；P2：5'-AACCAAAGTTAGTACCTCCTTCAGC-3'。全基因引物参考郭伟等[12]设计的6对引物进行全基因的扩增，引物均由北京赛百盛基因技术有限公司合成。

1.2.3 病毒DNA提取 取500μL F81细胞培养的病毒液，按照DNAiso Reagent说明书方法提取DNA，用30μL灭菌超纯水溶解后储存于-20℃备用。

1.2.4 病毒鉴定和全基因组克隆

1.2.4.1 病毒PCR鉴定 反应体系为25μL：模板DNA 3μL，10 X PCR Buffer 2.5μL，dNTP 2.0μL，P1 0.5μL，P2 0.5μL，Taq酶0.5μL，ddH20 16μL。95℃预变性5min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸lmin，共30个循环；最后72℃延伸10min。反应结束后进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.4.2 病毒电镜形态学观察 将盲传至第4代的病毒液，8 000 r/min离心10min后，取上清液，将上清液病毒浓缩后，0.5%磷钨酸负染，电镜下放大60 000倍，观察病毒粒子形态。

1.2.4.3 病毒全基因组克隆 按照郭伟等[10]建立的PCR程序进行扩增，回收各个目的片段，将其连接到pMD l8-T载体上，转化至DH-5α感受态细胞中，涂布于氨苄青霉素琼脂平板，37℃过夜培养。挑取单个菌落扩大培养，经PCR鉴定后送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。

1.2.5 全基因组序列比较与分析 将所分离到细小病毒株各个基因片段用DNAStar软件进行序列拼接，得到的全基因序列与GenBank参考毒株进行比对分析。对所获得的各VP2基因序列的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行比对分析。

2 结果

2.1 病毒的分离培养及PCR鉴定 20份病料同步接种到正常生长的F81细胞，盲传至第3代72 h，有4份出现明显的变形、聚堆、拉网结丝等细胞病变，继续带毒盲传至第5代均能出现典型细胞病变，而对照组细胞未出现任何病变。以F5代病毒液DNA做模板，应用设计的特异性引物从疫苗株和分离毒株中均扩增出685 bp的目的片段，与理论设计值大小相符(图1)。结果证实分离到了4株CPV，分别命名QN1/QN2/QN3/QN4。

2.2 电镜观察结果 将第5代F81细胞培养物经磷钨酸负染后进行电镜形态学观察，发现呈立体对称的，直径约20～25 nm的空心病毒粒子（图2）。

图1 病毒分离PCR结果

图2 电镜负染后的病毒粒子

2.3 CPV分离株全基因组克隆与序列分析 除QN3株序列总长为4 756 bp，其余3株为4 757 bp，其中5，UTR长153 bp，3，UTR长335 bp，ORF1全长2 007 bp，编码非结构蛋白基因NS1、NS2；ORF2全长2 255 bp，编码结构蛋白基因VP1、VP2；四株CPV之间全序列核苷酸同源性为99.31%，与国际参考毒株（CPV-N）的同源性分别为：98.9%、98.9%、99.0%和99.4%；与GenBank登录的10株具有代表性的CPV核苷酸序列比对，同源性为98.2%～99.9%，其中，四株CPV与6株国内参考毒株的同源性比4株国外参考毒株的同源性高，说明本分离株与国内分离毒株可能具有相同的起源。此外，本研究发现分离株在3，UTR有碱基插入和缺失存在，与CPV-N相比：QN1、QN2和QN3株在4 574～4 636、4 702～4 763和4 844～4 905位点以及QN4株在4 574～4 616和4 700～4 824位点有碱基缺失；与CPV-Y1相比：QN4株在4 844～4 905位点有碱基插入。

2.4 CPV分离株全基因系统进化分析 全基因系统进化树分析如图3所示，QN1、QN2和QN3株与广西分离株CPV-2a处于同一分支，亲缘关系较近；QN4株与甘肃分离株CPV LZ1处于同一分支，亲缘关系较近，与CPV Laika-1993株进化关系最远，其亲源关系较为疏远。总体而言，4株CPV与国内其他几株分离毒亲缘关系较近，尤其是与国内近期分离毒株间高度同源，同属一个亚型，而与CPV-N等国外毒株亲缘关系较远，说明所分离毒株可能由国内流行毒株进化而来。

图3 CPV分离株全基因组系统进化树

2.5 CPV分离株VP2基因与国内外分离株的核苷酸序列及推导氨基酸序列同源性比较 将4个CPV分离株与17个国内外分离株进行VP2基因的核苷酸序列及推导氨基酸序列同源性比较。结果表明，不同地域CPV分离株VP2基因序列同源性高，变异小，核苷酸同源性为98.5%～99.9%，推导的氨基酸同源性为97.4%～100.0%，但各分离株与疫苗株的同源性较低，差异大。与原始CPV-2a亚型相比，其VP2基因297位氨基酸发生了S到A替换，依此判定4个CPV分离株同属New CPV-2a亚型。

3 讨论

本实验室从送检的疑似犬细小病毒感染的发病犬粪便中分离出4株细小病毒，根据流行病学、实验室检测证实该分离株为CPV。为分析毒株的遗传演化，对分离株进行了全基因测序，结果表明，除QN3株的基因组全长为4 756 nt外，其余3株均为4 757 nt，4个分离株之间同源性为99.31%，与国际参考毒株（CPV-N）的同源性分别为：98.9%、98.9%、99.0%和99.4%；与GenBank登录的10株具有代表性的CPV全基因组核苷酸序列比对，同源性为98.2%～99.9%，说明国内外分离株基因序列差异不大，但从系统进化树分析上分析，4个分离株与国内毒株亲缘关系更近，处于同一大的分支上，说明山东地区犬细小病毒并没有形成独立的分支。此外，本研究发现分离株在3，UTR有插入和缺失位点存在，3，UTR是CPV mRNA翻泽的起始端，其序列的改变会影响病毒翻泽，从而可能影响病毒对细胞的感染能力[11-12]。

由于VP2基因序列涵盖了CPV所有的中和抗原表位，VP2若干个碱基及氨基酸的非同义置换则会改变病毒的宿主范围及抗原特性，所以对VP2基因的比较和分型具有非常重要的生物学意义[13]。结果表明，本试验克隆和测定的4株CPV结构蛋白编码的VP2全基因其核苷酸1 755 bp，编码氨基酸585个。与17个国内外分离株核苷酸同源性为98.5%～99.9%，推导的氨基酸同源性为97.4%～100.0%，说明VP2基因变异相对较少。氨基酸序列分析可知，与原始CPV-2a亚型相比，分离株297位氨基酸还发生了S到A替换，说明本次分离株同属于New CPV-2a亚型，这与王净等[14]分析一致，认为目前New CPV-2a亚型在中国占主导地位。由于321位点和324位点位于衣壳蛋白GH环，而该环上的氨基酸大部分处在病毒粒子的外表面，因此，这两处位点N到D、I到Y的替换可能会引起蛋白三维结构的改变，从而影响到CPV的宿主范围。此外，QN1第497位氨基酸Q到L的替换、QN2第2位氨基酸S到G的替换和QN4第151位氨基酸K到R的替换都未见报道，这可能与病毒的进化和致病性有关，有待了解这些部位氨基酸突变的确切生物学意义。

犬细小病毒从出现到目前虽仅有30多年的历史，但该病毒进化速度快，血清型也不断出现新的变异，该病毒引起的疾病仍然没有得到有效的控制。目前普遍使用的商品化疫苗株为CPV-2亚型，而国内主要的流行毒株为New CPV-2a亚型，这种流行毒株与疫苗毒株的差异可能是造成疫苗免疫失败原因之一。本研究通过分离近期流行毒株并进行一系列鉴定和分析，为有针对性地开发特异、高效的犬细小病疫苗奠定了基础。

[1]蔡宝祥.家畜传染病学[M].4版.北京：中国农业出版社，2001：354-356．

[2]Reed A P，Elaine V J，Timothy JM.Nucleotide sequence and genome organization of canine parvovirus[J].JVirol，1988，62：266-276.

[3]Chinchkar SR，Mohana B，Subramanian Hanumantha N Rao，et al.Analysis of VP2 gene sequences of canine parvovirus isolates in India[J].Arch Virol，2006，151：1881-1887.

[4]Lopez JA，de Turiso Cortes E，Martinez C，et al.Recombinant vaccine for canine parvovirus in dogs[J].J Virol，1992，66：2748-2753.

[5]潘红丽，仲飞，潘素敏，等.犬细小病毒NS1非结构蛋白可诱导细胞凋亡[J].微生物学报，2012，52（3）：367-373.

[6] Shackelton L A，Parrish C R，Truyen U，et al.High rate of viral evolution associated with the emergence of carnivore parvovirus[J].Proc Natl Acad Sci，2005，102：379-384.

[7]赵建军，闫喜军，吴威.犬细小病毒：从起源到进化[J].微生物学报，2011，51（7）：869-875.

[8] Jeoung SY，Ahn SJ，Kim D.Genetic analysis of VP2 gene of canine parvovirus isolates in Korea[J].JVetMed Sci，2008，70：719-722.

[9]Renzhou Zhang，Songtao Yang，Wei Zhang，et al.Phylogenetic analysis of the VP2 gene of canine parvoviruses circulating in China.Virus Genes[J].2010，40：397-402.

[10]郭伟，商晓桂，单同领，等.犬细小病毒上海分离株全基因的克隆及进化树分析[J].中国动物传染病学报，2009，17(3)：27-32.

[11]李润.犬细小病毒DD分离株的鉴定及基因组序列分析[D].北京：中国兽医药品监察所，2011：29-43.

[12]Chunmei Ju，Cheng Yi，Yikuan Ji，et al.Genome Sequence of Ca⁃nine Parvovirus Strain SC02/2011，Isolated from a Puppy with Se⁃vere Diarrhea in South China[J].JVirol，2012，86（24）：13805.

[13]Strassheim M L，Gruenberg A，Veijalainen P，etal.Two dominant neutralizing antigenic determinants of canine parvovirus are found on the threefold spike o f the virus capsid[J].Virology，1994，198（1）：175-184.

[14]王净，李英俊，李刚，等.犬细小病毒北京分离株VP2基因克隆及变异分析[J].中国兽医学报，2011，31（5）：649-653．