Beclin-1、LC3-II 在缺血后处理大鼠再灌注中的表达及意义

石秋艳，杨 斌，孙 原，范亚霞，张春阳，刘 冰

尽早恢复脑组织血液供应是减轻缺血性脑损伤和减少神经功能缺损的重要措施。如果超出脑组织对缺血、缺氧耐受的时间窗恢复血液供应，就会使神经细胞的结构和功能受到更加严重的伤害，甚至出现不可逆的病理改变，即发生脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)。如何在脑组织对缺血、缺氧耐受的时间窗内给予有效的神经细胞保护，已成为减轻脑缺血再灌注损伤的一个热门话题。凋亡性细胞死亡、自噬性细胞死亡和细胞坏死是神经细胞死亡的3 种方式［1］，目前正有越来越多的研究者关注自噬性细胞死亡［2］，避免自噬性细胞死亡有望成为减轻缺血再灌注损伤的新方法。发生缺血后，在长时间的再灌注之前，预先给予短暂的再灌注/再缺血循环即为缺血后处理，其可触发机体的内源性保护程序，增加组织或器官对长时间缺血再灌注的耐受性，但它对脑组织自噬的影响知之较少。本研究采用Zea-Longa 线栓法［3］制作大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型，观察不同时间缺血后处理后自噬的变化，探讨自噬在缺血后处理神经保护机制中的作用，为缺血性脑血管病的治疗提供理论依据和实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康雄性SD 大鼠50只，体重(250±50)g，由河北联合大学实验动物中心提供。随机将大鼠分为3 组:假手术组(sham operated control，Sham 组，n=10)、缺血再灌注组(ischemia reperfusion，I/R 组，n=10)、缺血后处理组(ischemic postcondtioning，IP 组，n=30)，IP 组按照缺血后处理15 s、30 s、1 min 分为3 个亚组(n=10)。

1.2 实验材料 兔抗鼠Beclin-1 抗体、兔抗鼠LC3-II 抗体(北京博奥森生物技术有限公司);一抗稀释液(碧云天生物技术研究所);羊抗兔二抗工作液(北京博奥森生物技术有限公司);浓缩型DAB试剂盒(中杉金桥);TTC(中杉金桥)。

1.3 动物模型制备 参照Zea-Longa 线栓法制备大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型。大鼠术前禁食12 h，10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，固定头部及四肢，碘伏消毒皮肤，取颈正中皮肤切口，分离皮下组织及肌肉，暴露右侧颈总动脉，分离迷走神经，暴露右侧颈外动脉和颈内动脉，结扎颈外动脉和颈总动脉，在颈总动脉近分叉处剪一小口，插入0.26～0.30 mm 线栓，前进约18～20 mm 有阻力感为止，留1 cm 线栓在皮肤外，缝合肌肉和皮质，酒精消毒皮肤，术中保持大鼠肛温在36 ℃～37 ℃。Sham 组不插线栓，余操作相同;I/R 组缺血2 h/再灌注24 h;IP 组缺血2 h，分别即刻再灌注15 s/缺血15 s、再灌注30 s/缺血30 s、再灌注1 min/缺血1 min，反复3 次完成后处理，再灌注至24 h。

1.4 指标检测及方法

1.4.1 神经功能障碍评分 参照Zea-Longa神经功能障碍评分。0 分:无明显神经功能障碍;1分:不能完全伸展左前肢;2 分:爬行时向左侧转圈;3 分:爬行时向左侧倾倒;4 分:无自主活动能力。

1.4.2 氯化三苯基四氮(TTC)染色 各组随机选取3 只大鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，快速取脑，放置-20 ℃10 min，冠状面均匀切片，片厚2 mm，2%TTC 溶液37 ℃避光染色30 min，每隔7～8 min 用眼科镊翻转一次，4%多聚甲醛固定24 h，数码相机拍照，输入计算机，图像分析软件Adobe Photoshop7.0 计算脑梗死体积(红色区为正常脑组织，白色区为梗死脑组织)百分比，即梗死脑组织体积占对侧正常脑组织体积百分比。

1.4.3 免疫组织化学染色 各组随机选取4只大鼠，10%水合氯醛腹腔注射深度麻醉，经左心室先后以生理盐水和4%多聚甲醛灌注固定，取视交叉后1～5 mm 处脑组织，4%多聚甲醛固定24 h 以上，常规石蜡包埋，做5 μm 连续切片备用。切片常规脱蜡至水;3%H2O2室温避光10 min 灭活内源性过氧化物酶;微波或高压修复抗原;滴加兔抗鼠Beclin-1、LC3-II 抗体，工作浓度1∶50，4 ℃过夜;复温后滴加羊抗兔二抗工作液，37 ℃1 h;DAB 显色8～12 min;苏木素复染2～3 min，分化后充分蓝化，脱水透明封片。各步骤之间用PBS 缓冲液洗5 min×3 次。用PBS 缓冲液代替一抗作阴性对照。结果判定及计数:Beclin-1、LC3-II 阳性细胞胞浆呈棕黄色，核呈蓝色;每只动物选取4 张切片，光学显微镜高倍镜(×400)视野下，每张切片观察5 个视野，计数阳性细胞，取均值。

1.4.4 电镜标本制作 各组随机选取3 只大鼠，10%水合氯醛深度麻醉，快速断头取脑，分离右侧海马组织(冰上操作)，取大小约1 mm3组织块，迅速置入预冷的4%戊二醛溶液中，4 ℃保存固定24 h 以上，1%饿酸后固定，丙酮逐级脱水，树脂包埋，切片机切片，片厚50 nm，枸橼酸铅染色，透射电镜观察自噬体、溶酶体及细胞超微结构。

1.5 统计学分析 实验结果用SPSS17.0 统计软件包分析处理。文中数据均以均数±标准差(±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，检验标准P＜0.05 具有统计学差异。

2 结果

2.1 神经功能障碍评分结果 Sham 组未见神经功能障碍表现，I/R 组及IP 组均表现出不同程度神经功能障碍(P＜0.01)，各IP 组症状轻于I/R 组(P＜0.05)，各IP 亚组间比较无显著性差异(P＞0.05)(见表1)。

2.2 脑梗死体积测定结果 Sham 组未见梗死灶形成;I/R 组及IP 组均可见不同程度梗死灶形成(P＜0.01);I/R 组脑梗死灶体积明显大于IP 组(P＜0.01)，IP-30 s 亚组和IP-15 s、1 min 亚组间脑梗死灶体积差异有显著性意义(P＜0.01)，IP-15 s 和IP-1min 亚组间脑梗死灶体积差异无显著性意义(P＞0.05)(见表1、图1)。

2.3 免疫组织化学染色结果

2.3.1 Beclin-1 Sham 组可见少量Beclin-1阳性细胞;I/R 组及IP 组均可见大量Beclin-1 阳性细胞(P＜0.01)，I/R 组Beclin-1 阳性细胞表达显著低于IP 组(P＜0.01)，IP-30 s 亚组和IP-15 s、1 min亚组相比较，Beclin-1 阳性细胞表达差异有显著性意义(P＜0.01)，IP-15 s 和IP-1 min 亚组相比较，Beclin-1 阳性细胞表达差异无显著差异(P＞0.05)(见表2、图2)。

2.3.2 LC3-II Sham 组可见少量LC3-II 阳性细胞;I/R 组及IP 组均可见大量LC3-II 阳性细胞(P＜0.01)，I/R 组LC3-II 阳性细胞表达显著低于IP组(P＜0.01)，IP-30 s 亚组和IP-15 s、1 min 亚组相比较，LC3-II 阳性细胞表达差异有显著性意义(P＜0.01)，IP-15 s 和IP-1 min 亚组间LC3-II 阳性细胞表达差异无显著性意义(P＞0.05)(见表2、图2)。

2.4 电镜下脑组织病理形态变化 电镜下可见Sham 组神经细胞核膜完整，染色质结构正常，胞质中细胞器形态正常，未见自噬体，可以观察到溶酶体的存在，数量较少;I/R 组及IP 组神经细胞核染色质固缩边集，呈现凋亡的超微形态结构，出现自噬小体，线粒体肿胀，线粒体嵴断裂，各级溶酶体数目增多，胞内可见大量空泡结构;IP 组自噬体数量较I/R 组增多，各IP 亚组间自噬体数量未见明显变化(见图3)。

表1 各组再灌注24 h 神经功能障碍评分、脑梗死体积百分比比较(±s)

与Sham 组比较* P＜0.01;与I/R 组比较△P＜0.05;与I/R 组比较#P＜0.01;与IP-15 s、1 min 亚组比较▽P＜0.01

表2 各组再灌注24 h Beclin-1、LC-II 阳性细胞数的比较(±s，个数/视野)

表2 各组再灌注24 h Beclin-1、LC-II 阳性细胞数的比较(±s，个数/视野)

与Sham 组比较* P＜0.01;与I/R 组比较#P＜0.01;与IPC-1 d、3 d 亚组比较△P＜0.01

图1 再灌注24 h 脑梗死体积

图2 再灌注24 h Beclin-1、LC-II 阳性细胞表达

图3 再灌注24 h 电镜脑组织病理形态

3 讨论

以往在发生长时间缺血再灌注之前给予某种措施诸如短时间缺血再灌注、药物腹腔注射或灌胃、低/高压氧气吸入、运动等减轻缺血再灌注损伤的研究比较多，但其难以在临床实际工作中开展，因此探索一种能够在脑梗死发生后给予的某种措施具有十分重要的应用价值。2003 年，Zhao 等［4］通过研究大鼠心肌缺血再灌注损伤，第一次得出缺血后处理能够减轻心功能损害的结论，但对于什么时间开始给予缺血后处理，每次给予再灌注/缺血循环的次数以及每次持续的时间目前尚没有统一的定论。本实验采取在缺血后即刻分别再灌注15 s/缺血15 s、再灌注30 s/缺血30 s、再灌注1 min/缺血1 min 的反复3 次的后处理方案，实验结果显示与I/R 组比较，IP组大鼠神经功能障碍评分明显减低(P＜0.05)，脑梗死体积明显缩小(P＜0.01)，IP-30 s 亚组最明显(P＜0.01)，两者均显著高于Sham 组(P＜0.01)。

细胞利用溶酶体途径实现过多或衰亡的细胞器及损伤蛋白的降解即为自噬［5］。在各种组织细胞几乎均能见到自噬现象，其可在细胞营养缺乏时降解无用的蛋白以供应细胞生存所需氨基酸、脂肪酸等物质。但在缺血再灌注时，其可被迅速激活并参与细胞死亡，细胞周围的环境和疾病进展的阶段决定了自噬的作用。研究发现酵母Atg6/Vps30 基因的同源物即为Beclin-1，其能够与III 型磷脂酰肌醇3 磷酸激酶(classIII PI3K)结合，形成复合物，亦可介导相关自噬蛋白定位在前自噬小体，调控自噬体形成［6］。因此，Beclin-1 对自噬调节作用尤为重要，在一定程度上可代表自噬的活性。哺乳动物细胞中酵母自噬基因8(Atg8)的同源基因即为LC3，存在于自噬体和溶酶体膜上，自噬体和溶酶体的数量可通过其表达的多少未反映，由此可将LC3 看作自噬体的标志分子［7，8］。透射电镜可观察到自噬体的存在，典型的自噬超微结构改变包括各种损伤的细胞器、空泡状双层膜结构形成、双层膜结构包绕损伤细胞器形成的自噬体、自噬体转运进入溶酶体腔形成的自噬溶酶体、以及不能被完全降解的细胞器残体等。

本实验结果显示与I/R 组比较，IP 组大鼠Beclin-1、LC3-II 蛋白表达(P＜0.01)及自噬体和或自噬溶酶体数量增多明显，IP-30 s 亚组最明显(P＜0.01)，两者均显著高于sham 组(P＜0.01)。

综上所述，缺血再灌注可使脑组织受损，进而激活自噬，缺血后处理可产生神经保护作用，且后处理30 s 作用最强，Beclin-1、LC3-II 蛋白表达上调可能参与其神经保护机制。进一步研究自噬在缺血后处理神经保护作用中的机制对于寻找减轻缺血再灌注损伤的有效途径以及临床治疗或药物干预的合适靶点具有重要意义。

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［3］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.ReversibLe middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.J Stroke，1989，20(1):84-91.

［4］Zhao ZQ，Corvera JS，Halkos ME，et al.Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion:comparison with ischemic preconditioning［J］.Am JPhysiol Heart Circ Physiol，2003，285:579-588.

［5］Cuervo AM，Dice JF.A receptor for the selective uptake and degradation of protein by lysosomes［J］.Science，1996，273(5274):501-503.

［6］Yang Z，Klionsky DJ.An overview of the molecular mechanism of autophagy［J］.Curr Top Microbiol Immunol，2009，335:1-32.

［7］Kabeya Y，Mizushima N，Ueno T，et al.LC3，a mammalian homologue of yeast Apg8p，is localized in autophagosome membranes after processing［J］.EMBO，2000，19(21):5720-5728.

［8］Mizushima N.Methods for monitoring autophagy［J］.Int J Biochem Cell Biol，2004，36(12):2491-2502.