垂子买麻藤中抗菌化学成分的再研究

陈丽君

（1. 浙江中医药大学药学院，浙江 杭州 310053；2. 浙江台州市立医院，浙江 台州 318000）

·药学研究·
PHARMACEUTICAL RESEARCH

垂子买麻藤中抗菌化学成分的再研究

陈丽君1,2*

（1. 浙江中医药大学药学院，浙江 杭州 310053；2. 浙江台州市立医院，浙江 台州 318000）

目的：进一步研究垂子买麻藤中抗菌化学成分。方法：利用正相硅胶柱层析、葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析、半制备反相高效液相色谱等手段从垂子买麻藤茎杆的乙醇提取物中分离纯化得到9个单体化合物，采用电喷雾电离质谱和核磁共振氢谱等波谱分析方法对其进行结构鉴定，并以耐甲氧西林金葡菌(MRSA)为试验菌，考察其体外抑菌活性。结果：经波谱分析鉴定，分离所得9个单体化合物分别为原儿茶酸甲酯、买麻藤醇、白藜芦醇、原儿茶酸、香草醛、阿魏酸、isorhapontin、gnetifolin E和gnetuhainin A，其中原儿茶酸甲酯、买麻藤醇、原儿茶酸、香草醛、阿魏酸、gnetifolin E和gnetuhainin A为首次从该植物中分离得到；体外抑菌活性测试表明，原儿茶酸甲酯、白藜芦醇、原儿茶酸和香草醛对MRSA具有抑制活性，其最低抑菌浓度分别是2 560、256、1 280和2 560 mg•L-1，最小杀菌浓度分别是2 560、1 280、5 120和2 560 mg•L-1，而其他单体化合物则无此活性。结论：垂子买麻藤中存在多种不同结构、不同活性的抗菌化学成分。

垂子买麻藤；乙醇提取物；化学成分；结构鉴定；耐甲氧西林金葡菌；体外抑菌活性

自从英国人Jevons于1961年首次发现耐甲氧西林金葡菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)以来，MRSA感染以惊人的速度在世界范围内蔓延，且感染率呈上升趋势，极易引起医院内爆发性流行[1]。MRSA具多药耐药性，且感染多发生于免疫缺陷者以及老弱、烧伤和手术患者，这些特性造成其感染的治疗难度大、病死率高[2]。目前，MRSA感染已与乙型肝炎和艾滋病共同被列为世界范围内最难治疗的三大感染性疾病，严重威胁着人类健康。因此，寻找与开发抗MRSA等革兰阳性耐药菌重度感染的有效药物成为当今医药研究的热点之一。

有研究者在从中国传统植物中筛选具有抑制MRSA活性的化学成分过程中，发现垂子买麻藤(Gnetum pendulum)茎杆的乙醇粗提物具有较好的抑菌活性，并对该植物的化学成分进行了初步研究，从中分离得到两个抗菌单体化合物3,5-二羟基-4-甲氧基均二苯代乙烯(1)和银松素(2)[3-4]；且进一步的活性测试发现，不但上述两个化合物具有很好的抗菌作用，而且其他流份也显示出抑制MRSA的活性。因此，为了阐明垂子买麻藤抗菌活性的物质基础及从中获得更多的抗菌活性成分，有必要对该植物的化学成分进行更详细的研究。

本文对垂子买麻藤茎杆的乙醇提取物作进一步分离，获得除化合物1和2以外的9个化合物，经波谱分析鉴定为：买麻藤醇(gnetol，3)、白藜芦醇(resveratrol，4)、isorhapontin (5)、gnetifolin E (6)、原儿茶酸甲酯(protoeatechuic acid methyl ester，7)、原儿茶酸(protoeatechuic acid，8)、香草醛(vanillin，9)、阿魏酸(ferulic acid，10)、和gnetuhainin A(11)，体外活性检测发现，其中化合物3、4、7、8和9具有抑制MRSA的活性，化合物5、6、10和11则无此活性。

1 仪器与材料

Agilent 1100型高效液相色谱（HPLC）仪，半制备ODS反相色谱柱（250 mm×9.4 mm）（美国Agilent公司）；Bruker-AVANCE400型核磁共振(NMR)仪（德国Bruker公司）；Thermo Finnigan- LCQ Advantage质谱(MS)仪（美国Thermo公司）；薄层色谱（TLC）用硅胶GF254，柱层析硅胶（100～200目）（青岛海洋化工厂）；葡聚糖凝胶Sephadex LH-20（美国GE公司）；其他常规试剂均为分析纯。MRSA（中国科学院北京微生物研究所）；Mueller-Hinton(M-H)肉汤培养基（杭州天和生物公司）。垂子买麻藤茎杆于2003年7月采自中国西双版纳，经东北农业大学胡宝忠教授鉴定属于垂子买麻藤（Gnetum pendulum C. Y Cheng），标本存放于东北农业大学生命科学院植物系标本室。

2 方法

2.1 提取与分离

取垂子买麻藤茎杆2.0 kg，粉碎，用95%乙醇回流提取3次，得浸膏170 g；将浸膏经硅胶柱层析，分别以石油醚/丙酮（95 ∶ 5～70 ∶ 30）和氯仿/甲醇（95 ∶5～60 ∶ 40）系统梯度洗脱，每流份250 mL，共收集115份；各流份经TLC检测，合并得到H1～H4等4个部分，经抑制MRSA活性测试，将H1和H3分为活性部分，H2和H4分为非活性部分。活性部分H1经硅胶柱层析，以氯仿/甲醇（95 ∶ 5～90 ∶ 10）系统梯度洗脱，再用SephadexLH-20凝胶柱层析(以甲醇洗脱)纯化，得到化合物3(13 mg)、4(24 mg)、8(52 mg)和9(30 mg)；活性部分H3经硅胶柱层析，以石油醚/丙酮（80 ∶ 20～70 ∶ 30）系统梯度洗脱，再用Sephadex LH-20凝胶柱层析(以甲醇洗脱)纯化，得到化合物7(7 mg)。非活性部分H2经硅胶柱层析，以石油醚/丙酮（85 ∶ 15～70 ∶ 30）系统梯度洗脱，再用Sephadex LH-20凝胶柱层析(以甲醇洗脱) 纯化，得到化合物10(14 mg)；非活性部分H4经硅胶柱层析，以氯仿/甲醇（90 ∶ 10～80 ∶ 20）系统梯度洗脱，再用Sephadex LH-20凝胶柱层析(以甲醇洗脱)，并经半制备反相HPLC，以甲醇/水（50 ∶ 50）系统洗脱，流速为

1.5 mL·min-1，检测波长为254 nm，分离得到化合物5(15.6 min，12 mg)、6(13.2 min，8 mg)和11(14.6 min，6 mg)。

2.2 体外抑菌试验

2.2.1 对粗流分进行的纸片扩散法试验 参照文献[5]，取3块灭菌的M-H平板（直径90 mm），将37 ℃培养18 h的液体受试菌按0.3 %加入50 ℃左右的灭菌M-H肉汤琼脂培养基中，充分混匀，倾倒于M-H平板，每板20 mL；将灭菌的滤纸片（直径6 mm）分别浸入粗流份H1～H4的溶液中，再取出小心地贴在含菌的M-H平板上（每个粗流份浸3张滤纸片，每块M-H平板贴4张滤纸片），37 ℃培养24 h，观察抑菌圈。

2.2.2 分离所得单体化合物最低抑菌浓度和最小杀菌浓度的测定 参照文献[5-6]，依据美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）的标准，采用常量肉汤稀释法测定单体化合物的最低抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）。

菌液的制备：将受试菌接种于M-H平板，37 ℃孵育18～24 h，取菌苔适量于M-H肉汤中，37 ℃孵育6～8 h，以适量生理盐水调整菌液浓度至1×108～2×108CFU·mL-1(0.5麦氏单位)，备用。

系列化合物测试液的配制：将“2.1”节中提取分离的单体化合物溶于二甲基亚砜中，用M-H肉汤稀释制成1 024 mg·L-1初液。排列无菌试管12支，每管各加入M-H肉汤1 mL，然后，在第1管加入配制的1 024 mg·L-1化合物初液1 mL，混匀，吸取1 mL至第2管，混匀，再吸取1 mL至第3管，如此连续倍比稀释至第10管，并从第10管吸取1mL弃去，第11管为不含化合物的对照管，第12管为只含培养基的对照管。这样，第10～1管中含有1.024～512 mg·L-1不同质量浓度的化合物溶液各1 mL。若测得化合物的MIC大于512 mg·L-1, 则采用10倍的化合物初液质量浓度（10 240 mg·L-1）进行二倍稀释法检测，以此类推。

MIC和MBC的测定：将受试菌菌液浓度以生理盐水调整至106CFU·mL-1，分别取1 mL加入各试管化合物溶液中，使试管中细菌终浓度为5×105CFU·mL-1，37 ℃孵育24 h，从化合物质量浓度由低到高观察各试管溶液，若某试管溶液开始出现澄清，表明受试菌生长受抑，该试管化合物溶液有抑菌作用，其化合物质量浓度即MIC。

从受试菌生长受抑的各试管中分别吸取0.1 mL培养液，涂布于M-H平板上，37 ℃孵育24 h，无菌落出现的平板上所用相应试管中的最低化合物质量浓度即MBC。

3 结果

3.1 分离所得单体化合物性状与结构鉴定

化合物3为白色粉末，易溶于丙酮、甲醇。ESIMS m/z∶ 243 [ M-H]-。1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ∶ 7.37 (1H, d, J = 16.6 Hz, H-7), 7.26 (1H, d, J = 16.6 Hz, H-8),

6.83 (1H, t, J = 8.0 Hz, H-12), 6.34 (2H, d, J = 2.0 Hz, H-2, 6), 6.29 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-11, 13), 6.08 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-4)。参照文献[7]，鉴定化合物3为买麻藤醇。

化合物4为白色粉末，易溶于丙酮、甲醇。ESIMS m/z∶ 227 [ M-H]-。1H NMR (CD3OD, 400 MHz) δ∶ 7.35 (2H, dd, J = 2.0, 7.8 Hz, H-10, 14), 6.97 (1H, d, J = 16.4 Hz, H-7), 6.78 (1H, d, J = 16.4 Hz, H-8), 6.75 (2H, dd, J = 2.0, 7.8 Hz, H-11, 13), 6.44 (2H, d, J = 2.1 Hz, H-2, 6), 6.15 (1H, t, J = 2.1 Hz, H-4)。参照文献[8]，鉴定化合物4为白藜芦醇。

化合物5为白色无定形粉末，易溶于丙酮、甲醇。ESI-MS m/z∶ 443 [M+Na]+。1H NMR (CD3COCD3, 400 MHz) δ∶ 7.21 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-10), 7.08 (1H, d, J = 16.3 Hz, H-8), 7.01 (1H, dd, J = 1.8, 8.1 Hz, H-14), 6.95 (1H, d, J =

8.1 Hz, H-13), 6.95 (1H, d, J = 16.3 Hz, H-7), 6.80 (1H, s, H-6), 6.66 (1H, s, H-2), 6.48 (1H, t, J = 2.4 Hz, H-4), 4.93 (1H, d, J = 7.7 Hz, Glc 1’), 3.44- 3.88 (7H, m, Glc 2’-6’)。参照文献[9]，鉴定化合物5为isorhapontin。

化合物6为白色粉末，易溶于丙酮、甲醇。ESIMS m/z∶ 443 [M+Na]+。1H NMR (CD3COCD3, 400 MHz) δ∶ 7.19 (1H, d, J = 1.9 Hz, H-10), 7.08 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-14), 6.99 (1H, d, J = 16.3 Hz, H-8), 6.98 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-13), 6.93 (1H, d, J = 16.3 Hz, H-7), 6.50 (2H, d, J = 2.2 Hz, H-2, 6), 6.23 (1H, t, J = 2.2 Hz, H-4), 4.90 (1H,d, J = 7.2 Hz, Glc 1’), 3.42- 3.81 (7H, m, Glc 2’-6’)。参照文献[9]，鉴定化合物6为gnetifolin E。

化合物7为无色油状物，易溶于丙酮、甲醇。ESIMS m/z∶ 167 [ M-H]-。1H NMR (CD3COCD3, 400 MHz) δ∶

7.60 (1H, d, J = 2.0, 8.4 Hz, H-6), 7.57 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2), 6.92 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5), 3.91 (3H, s, OCH3)。参照文献[10-11]，鉴定化合物7为原儿茶酸甲酯。

化合物8为无色油状物，易溶于丙酮、甲醇。ESIMS m/z∶ 153 [ M-H]-。1H NMR (CD3OD, 400 MHz) δ∶ 7.44 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2), 7.43 (1H, dd, J = 2.0, J = 8.4 Hz, H-6), 6.80 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5)。参照文献[10-12]，鉴定化合物8为原儿茶酸。

化合物9为黄色油状物，易溶于丙酮、甲醇。ESIMS m/z∶ 151 [ M-H]-。1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ∶ 9.83 (1H, s, CHO), 7.43 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2), 7.42 (1H, dd, J = 2.0, J = 8.4 Hz, H-6), 7.04 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5), 6.21 (1H, s, 4-OH), 3.97 (3H, s, 3-OCH3)。参照文献[13]，鉴定化合物9为香草醛。

化合物10为白色粉末，易溶于丙酮、甲醇。ESIMS m/z∶ 193[ M-H]-。1H NMR (CD3COCD3, 400 MHz) δ∶ 8.16 (1H, s, 7-OH), 7.58 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-7), 7.34 (1H, d, J =

1.9 Hz, H-2), 7.14 (1H, dd, J = 1.9, 8.4 Hz, H-6), 6.87 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5), 6.40 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-8), 3.93 (3H, s, 3-OCH3)。参照文献[14]，鉴定化合物10为阿魏酸。

化合物11为白色无定形粉末，易溶于丙酮、甲醇。ESI-MS m/z∶ 471 [M+H]+。1H NMR (CD3COCD3, 400 MHz) δ∶ 7.25 (2H, d, J = 8.6 Hz, H-2a, 6a), 7.06 (1H,d, J = 8.4 Hz, H-6b), 6.95 (1H, d, J = 16.4 Hz, H-7a), 6.79 (1H,d, J =

16.4 Hz, H-8a), 6.78 (2H, d, J = 8.6 Hz, H-3a, 5a), 6.74 (1H,d, J = 2.1 Hz, H-14a), 6.49 (1H,d, J = 2.3 Hz, H-3b), 6.40 (1H,d, J = 2.1 Hz, H-12a), 6.34 (2H,d, J = 2.3 Hz, H-10b, 14b), 6.33 (1H,dd, J = 2.3, 8.4 Hz, H-5b), 6.24 (1H, t, J = 2.3 Hz, H-12b),

5.81 (1H, d, J = 3.8 Hz, H-7b), 4.55 (1H, d, J = 3.8 Hz, H-8b)。参照文献[15]，鉴定化合物11为gnetuhainin A。

3.2 体外抑菌活性

3.2.1 粗流份活性 37 ℃培养24 h后，在含菌的M-H平板上，浸有粗提物H1和H3的滤纸片周围出现直径均值分别为20和25 mm（n=3）的抑菌圈，说明H1和H3有抑菌活性；而浸有粗提物H2和H4的滤纸片周围未见抑菌圈，说明H2和H4无抑菌活性。

3.2.2 分离所得单体化合物的最低抑菌浓度和最小杀菌浓度 活性测试显示化合物3、5、6、10和11对MRSA无抑制活性，其他提取分离的各单体化合物的MIC和MBC测定结果见表1。

表 1 分离所得单体化合物与化合物1和2对MRSA的MIC及MBC的比较Table 1 Comparison of MIC and MBC against MRSA among the isolated compounds and compounds 1-2

4 讨论

为了进一步系统研究垂子买麻藤中的抗菌活性成分，本文从该植物茎杆的乙醇提取物中又分离和鉴定出9个单体化学成分，并以MRSA作为试验菌，考察了它们的体外抑菌活性，发现化合物4、7、8和9对MRSA具有一定的抑制作用。笔者通过文献调研发现，化合物3、6、7、8、9、10和11为首次从该植物中分离得到。

而且，本研究发现，垂子买麻藤中的抗菌活性成分除了芪类化合物外，还有酚酸类成分。值得注意的是，同为芪类的化合物4与1和2具有相似的抗MRSA活性，而与它们结构相似的芪类化合物3、5和6则无此活性，其中，活性较好的化合物2与无活性的化合物3在结构上的差异仅是在10和14位少了2个羟基取代；另外，化合物2的活性好于化合物4，表明12位羟基取代降低了这类化合物的抗MRSA活性。因此，本研究为进一步开展有关芪类化合物抗MRSA的构效关系和作用机制的研究奠定了基础。

[参 考 文 献]

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Restudy on the Chemical Constituents with Antibacterial Activity from Gnetum pendulum

CHEN Lijun1,2
( 1. School of Pharmaceutical Science, Zhengjiang University of Traditional Chinese Medicine, Hangzhou 310053, China; 2. Zhejiang Taizhou Municipal Hospital, Taizhou 318000, China)

Objective: To restudy the chemical constituents with antibacterial activity from Gnetum pendulum. Methods: Using normal phase silica gel column chromatography, Sephadex LH-20 gel column chromatography and semi-preparative RP-HPLC, nine compounds were isolated from the ethanol extract of Gnetum pendulum and their structures were identifed by ESI-MS and1H NMR. Using methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA) as test bacteria, the in vitro antibacterial activities of the isolated compounds were investigated. Results: The nine isolated compounds were identified respectively as protoeatechuic acid methyl ester, gnetol, resveratrol, protoeatechuic acid, vanillin, ferulic acid, isorhapontin, gnetifolin E and gnetuhainin A by spectroscopic analysis, among which protoeatechuic acid methyl ester, gnetol, protoeatechuic acid, vanillin, ferulic acid, gnetifolin E and gnetuhainin A were isolated from this plant for the frst time. In vitro tests of antibacterial activity showed that among them, protoeatechuic acid methyl ester, resveratrol, protoeatechuic acid and vanillin had potent antibacterial activities against MRSA, their MICs (mg•L-1) were 2 560, 256, 1 280 and 2 560 and MBCs (mg•L-1) were 2 560, 1 280, 5 120 and 2 560, respectively, but the others had no activity. Conclusion: There are a variety of chemical constituents with different structures and antibacterial activities in Gnetum pendulum.

Gnetum pendulum; ethanol extract; chemical constituent; structural identifcation; methicillin-resistant Staphylococcus aureus; in vitro antibacterial activity

R284; R978

B

1001-5094（2014）08-0597-05

接受日期：2014-07-16

*通讯作者: 陈丽君,主管药师,从事药物分配及管理工作；

Tel:0576-88858228；E-mail：zhechenlijun@163.com