酶辅助法提取藕节中总黄酮及·OH清除活性研究

李会端，李云兴

（楚雄师范学院,云南楚雄 675000）

酶辅助法提取藕节中总黄酮及·OH清除活性研究

李会端，李云兴

（楚雄师范学院,云南楚雄 675000）

优选藕节中总黄酮的提取工艺条件,并研究其对羟自由基（·OH）的清除活性。采用纤维素酶辅助法提取藕节中的总黄酮,以70%乙醇固定提取,固定料液比为1∶20 g·m L-1和回流时间为1 h。设计单因素试验初步探究了酶浓度、酶解温度、酸碱度、酶解时间4个单因素条件对总黄酮提取率的影响,设计L9（34）正交试验确定了藕节中总黄酮提取的较佳试验条件。结果显示,酶浓度0.20 mg·m L-1,酶解温度55℃,pH为5.0,酶解时间2.5 h为藕节中的总黄酮提取的较佳条件,藕节中总黄酮提取率为2.680%。探究了藕节黄酮提取液对·OH的清除活性,与BHT的抗氧化剂活性对照,藕节总黄酮提取液对·OH有较强的清除活性。

酶辅助法；藕节；总黄酮；提取率；单因素试验；正交试验；清除活性

黄酮类化合物泛指2个苯环中间通过3个碳原子连接形成的一系列化合物。黄酮类化合物具有抗氧化、抗癌、消炎、杀菌、抗病毒和调节肌体免疫力等功效［1-3］。黄酮类化合物的提取方法有传统浸提法、超声波提取法、微波提取法、超临界流体萃取法及酶解法［4］。由于植物细胞壁的束缚作用,使得总黄酮在提取过程中不易溶出。纤维素酶能降解植物细胞壁的纤维素骨架,增加细胞内活性成分的溶出,进而释放出黄酮。纤维素酶辅助法提取植物中的总黄酮,具有操作简单、提出率高等特点。酶解法提取山楂中总黄酮,提取率高达（2.67± 0.06）%［5］。莲藕属睡莲科植物,在我国有悠久的栽培历史。藕节为藕的干燥根茎节部。藕有较高的食用营养价值,但藕节因不能进食往往容易被人们所忽视［6-8］。余美料等［9］采用纯物理的工艺流程提取莲藕中黄酮类物质,利用紫外线分光光度法测得样品中总黄酮的含量为1.13%。作者拟采用纤维素酶酶解法提取藕节中总黄酮,通过单因素和正交试验,探究藕节中总黄酮提取工艺的较佳试验条件,旨在为从藕节中黄酮类化合物的提取和开发利用提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 原料、试剂与仪器

干藕节（楚雄同济堂一中店,产地昆明）粉碎,备用。无水乙醇；纤维素（＞30 U·mg-1）；芦丁标准品、二丁基羟基甲苯、水杨酸、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠、硫酸亚铁、双氧水、氯化铝（分析纯）；三氯化铁；锌粉；亚硝酸钠；硝酸铝；氢氧化钠等。

722型光栅分光光度计（山东高密彩虹分析仪器有限公司）,CP214c电子天平,HH-S2s恒温水浴箱,J1050型托盘天平,DFY-500 500 g摇摆式高速中药粉碎机,电热鼓风恒温干燥箱,回流装置,蒸馏装置,容量瓶,吸量管等。

1.2 试验方法

1.2.1 总黄酮提取率的计算方法

以芦丁标准品为对照,测定藕节中总黄酮的提取率,藕节总黄酮提取液的显色反应参考文献［10］。分光光度计测量吸光度（D）值,与总黄酮浓度服从Lambert-Beer定律。将藕节提取液的吸光值代入线性回归方程,计算提取液中总黄酮浓度,计算藕节中总黄酮提取率。

C0=C×V÷V0,χ/%=100C0÷（2.000× 1 000）×100。

式中,χ藕节中总黄酮的含量,C为稀释后浓度,C0为原提取液浓度。

1.2.2 总黄酮提取液对羟自由基的清除活性

参照Fenton反应体系。若向该体系中加入藕节提取液,与水杨酸竞争·OH,导致有色络合物生成量减少。固定反应时间,在510 nm处测量藕节提取液的D值,与空白液对照,测定藕节中总黄酮对·OH的清除率。清除率计算公式：

·OH的清除率/%=（D0-Dx+Dx0）÷ D0×100。

式中,D0为空白对照溶液吸光度,Dx为提取液吸光度,Dx0为不加H2O2提取液的本底吸光度。

1.3 芦丁标准曲线绘制与线性关系考察

准确称取干燥的芦丁样品0.010 0 g,用70%乙醇充分溶解,转移至50 m L容量瓶中用同样浓度的乙醇稀释定容至刻度,摇匀,备用。移取0.5 m L芦丁标准液于50 m L容量瓶中,芦丁标准液的显色反应参考文献,以试剂空白做参比,在460～540 nm之间测量D值,确定最大吸收峰波长。

分别移取芦丁标准液0.00,0.50,1.50,2.50, 3.50,4.50,5.50,6.50 mL于50.00 mL容量瓶中,在最大波长处测定D值,绘制标准曲线。

1.4 提取液的定性试验

称取2.000 0 g样品置于50 m L圆底烧瓶中,加入40 m L 70%乙醇,水浴回流提取1 h。即得总黄酮提取液。

分别移取1.00 m L藕节总黄酮提取液和芦丁标准液于小试管中,第1组试管加入少许锌粉,再滴加几滴浓盐酸,振荡,必要时微热,观察试验现象。第2组试管滴加几滴硝酸铝溶液,振荡,观察试验现象。第3组试管滴加几滴三氯化铁溶液,振荡,观察试验现象。

1.5 单因素试验

分别准确称取2.000 0 g藕节粉于6支50 m L圆底烧瓶中,单因素处理后,再分别加入28 m L乙醇回流提取1 h,抽滤,洗涤,合并滤液和洗涤液转入50 mL容量瓶,用乙醇定容。

1.5.1 纤维素酶浓度对总黄酮提取率的影响

向6支圆底烧瓶中分别加入12 m L纤维素酶浓度为0.05,0.10,0.15,0.20,0.25,0.30 mg· m L-1的70%的乙醇,调节pH值为5.00,在50℃恒温水浴中酶解1.5 h。

1.5.2 酶解温度对总黄酮提取率的影响

向6支圆底烧瓶中各加入12 m L纤维素酶浓度为0.15 mg·mL-1的70%的乙醇,调节pH值为5.00,分别在40℃,45℃,50℃,55℃,60℃, 65℃恒温水浴中酶解1.5 h。

式(20)～式(22)中，th的认领时间TExch介于其自身的开始时间TBh与操作oph的开始时间之间，且th的结束时间TEh与下一个任务节点th+1的开始时间TBh+1及操作oph的结束时间相等，即满足

1.5.3 酶解pH对总黄酮提取率的影响

向6支圆底烧瓶中各加入12 m L纤维素酶浓度为0.15 mg·mL-1的70%的乙醇,分别调节pH值为3.50,4.00,4.50,5.00,5.50,6.50,在50℃恒温水浴中酶解1.5 h。

1.5.4 酶解时间对总黄酮提取率的影响

向6支圆底烧瓶中各加入12 m L纤维素酶浓度为0.15 mg·m L-1的70%乙醇,调节pH值为5.00,在50℃恒温水浴中分别酶解0.5,1.0, 1.5,2.0,2.5,3.0 h。

1.6 正交试验

根据酶浓度（A）、酶解温度（B）、酶解pH值（C）和酶解时间（D）等单因素试验所确定的范围,以藕节中黄酮含量为研究对象设计正交试验,采用L9（34）的正交表来确定最优方案。1-3水平：A为0.20,0.25和0.30 mg·m L-1；B为50℃,55℃和60℃；C为4.5,5.0和5.5；D为1.5,2.0和2.5 h。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线与线性关系方程

图1 芦丁标准溶液的吸收光谱

2.2 总黄酮提取液定性

表1表明,显色反应现象与黄酮类化合物显色反应现象相同,表明藕节中含有黄酮类化合物［10］。

表1 藕节总黄酮提取液的显色反应

2.3 单因素对总黄酮提取率的影响

2.3.1 酶浓度

图2表明,随着纤维素酶浓度增加,总黄酮提取率明显提高,当酶浓度为0.20 mg·m L-1时,黄酮提取率达到最大,此后增加纤维素酶浓度,总黄酮提取率开始下降。试验结果表明,藕节总黄酮提取的较佳酶浓度为0.20 mg·m L-1。酶浓度为0.20 mg·m L-1时酶解效率最大,再增加酶浓度,酶解效率趋于平衡。

图2 酶浓度对总黄酮提取率的影响

2.3.2 温度

图3表明,在40～55℃,随着酶解温度升高总黄酮提取率显著增加,酶解温度达55℃时,总黄酮提取率最大,此后随着酶解温度升高,总黄酮提取率迅速降低。分析原因,随着酶解温度升高,酶部分失去活性,温度升高导致先溶出的黄酮类化合物部分分解,总黄酮提取率降低。

图3 酶解温度对总黄酮提取率的影响

2.3.3 pH值图4表明,随pH值增大,藕节总黄酮提取率明显增加,当pH为5.0时,总黄酮提取率最大,继续增加pH,总黄酮提取率开始降低。分析原因,酶在特定酸碱度下,酶解活性最大,过酸或过碱都会使得酶的活性降低,甚至丧失。藕节总黄酮提取试验中纤维素酶的最佳活性pH值为5.0。

图4 酶解pH值对总黄酮提取率的影响

2.3.4 酶解时间对总黄酮提取率的影响

图5表明,随着酶解时间延长,总黄酮提取率显著增加,酶解时间为2.5 h时,总黄酮提取率最高,再延长酶解时间,总黄酮提取率开始降低。分析原因为时间太短,酶解不充分,总黄酮提取不完全；时间过长,部分黄酮类化合物会分解,导致总黄酮提取率降低。

图5 酶解时间对总黄酮提取率的影响

2.4 多因素对总黄酮提取率的影响

表2表明,用70%乙醇溶液作提取溶剂,酶浓度0.20 mg·mL-1,酶解温度55℃,酶解pH值为5.0,酶解时间为2.0 h,即A1B2C2D2为最佳提取条件。A极差最小,即酶浓度对藕节总黄酮提取率影响最小；B极差最大,即酶解温度对藕节总黄酮提取率影响最大。正交试验确定的各因素对纤维素酶辅助法提取藕节总黄酮的影响程度依次为B＞D＞C＞A。

按照上述最佳提取条件进行验证性试验,进行3组平行试验,纤维素酶辅助法提取藕节中总黄酮平均提取率为2.68%。

表2 正交试验结果

2.5 藕节总黄酮提取液对·OH清除活性研究

按照1.1.2操作,参考Fenton体系,加入不同体积藕节提取液,在510 nm处测D,扣除提取液本底吸收［10］。进行3组平行试验,代入公式计算藕节总黄酮提取液对·OH清除率。以BHT对照,比较2种抗氧化剂对·OH的清除活性（图6）。藕节总黄酮提取液对·OH有清除活性,且随着提取液体积增加,清除率逐渐增加。试验结果显示藕节总黄酮提取液对· OH清除活性要高于相同体积的BHT。

图6 总黄酮提取液和BHT对·OH清除活性比较

3 小结和讨论

通过采用纤维素酶辅助法提取藕节中总黄酮, 70%乙为醇固定提取剂,料液比为1∶20 g·m L-1和回流时间为1 h,考查纤维素酶浓度、酶解温度、酶解pH值及酶解时间4个单因素对藕节总黄酮提取率的影响,设计正交试验确定了藕节总黄酮提取的较佳条件为：纤维素酶浓度为0.20 mg·m L-1,酶解温度55℃,pH值为5.0,酶解时间为2.0 h,测得藕节总黄酮提取率为2.68%。较文献报道的莲藕果实中总黄酮提取率1.30%要高出2倍,可见莲藕不同部位总黄酮含量差异较大。纤维素酶辅助法提取藕节总黄酮的方法酶用量少,操作简便,提取率高。与70%乙醇回流提取法相比,总黄酮提取率有显著增加。初步探究了藕节总黄酮提取液对·OH清除活性。对照试验结果显示,藕节总黄酮提取液对·OH的清除活性高于相同浓度的BHT。

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（责任编辑：张瑞麟）

TS 201.2

A

0528-9017（2014）03-0383-04

文献著录格式：李会端,李云兴.酶辅助法提取藕节中总黄酮及·OH清除活性研究［J］.浙江农业科学,2014（3）：383-386.

2013-11-01

云南省应用基础研究项目（2012FD050）；楚雄师范学院科学研究基金项目（11YJGG01）

李会端（1983-）,女,讲师,博士,研究方向为天然食品化学成分分析及应用研究。E-mail：lhd08@cxtc.edu.cn。