檀应华 黄林彬, 严兴洪,①
(1.上海海洋大学水产与生命学院 上海 201306;2.上海海洋大学省部共建水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室 上海 201306)
紫菜是经济价值很高的栽培海藻之一,其产品深受中、日、韩等国人民的喜爱。我国主要栽培坛紫菜和条斑紫菜,其中坛紫菜是我国的特有种,属暖温性红藻,被广泛栽培于浙、闽、粤三省的沿海,其年产量约占全国紫菜年总产量的75%(马家海等,1996)。坛紫菜是一种广盐性海藻,适合在营养盐丰富的入海河口附近栽培,但是目前人工栽培所用的种质基本上为野生种,经过数十年的连续使用,未经选育,对低盐、高温和病害等逆境的耐受性大大降低(游华,1999;严兴洪等,2008b;宋武林,2009;王长青等,2011)。在栽培期间,尤其是刚下海挂网的壳孢子苗,如果遭遇强台风或者河流上游发生持续性的强降雨,可使栽培海域表层的海水盐度急剧下降,造成壳孢子苗生长变慢或脱苗,影响产量。因此,生产上亟需低盐耐受性强的优良品系来替代野生品系。人工选育的坛紫菜耐低盐品种(系)不仅能保证大规模栽培的顺利进行,而且还有利于在近河口的低盐度海区栽培紫菜,拓宽栽培海域,缓解传统紫菜栽培海区密度过大的压力。另外,如果能在靠近长江口等富营养化较严重的低盐度海区栽培紫菜,对水域生态的修复具有重要价值。
本实验室通过人工选育已获得一个耐低盐的坛紫菜突变品系(YZ-7),它的体细胞及再生叶状体均表现出良好的耐低盐性能(严兴洪等,2008a)。本文旨在通过对该品系的后代和叶状体进行耐低盐性测试,验证其耐低盐的性状是否能稳定遗传,以期选育出可用于大规模栽培的耐低盐新品种,促进我国紫菜产业的可持续发展。
本实验所用坛紫菜野生品系(WT,PT-001),从采自福建省平潭岛岩礁上的一颗自然生长的叶状体中分离所得;坛紫菜突变品系(YZ-7)通过对WT叶状体进行人工辐射诱变和低盐胁迫筛选获得(严兴洪等,2005),两个品系均以自由丝状体的形式保存于实验室内,保存方法同Kato等(1984)。
1.2.1WT和YZ-7叶状体圆盘的耐低盐性测试 坛紫菜叶状体的室内培养方法同梁志强(2004)。用打孔器(φ=4mm)分别从WT和YZ-7的叶状体(日龄均为40d)上各取10个圆盘体,置于同一个培养瓶(500mL)中进行充气培养(吕峰等,2010),培养液的盐度为8,由盐卤海水、蒸馏水和 MES培养基配制而成(王素娟等,1986)。培养条件:温度为 24°C,光量子通量密度为50µmol photons/(m2·s),光周期为 10L︰14D,每隔 5d更换一次培养液,并测量一次圆盘体的大小。
1.2.2WT和YZ-7壳孢子及叶状体的耐低盐性测试
壳孢子的耐低盐性测试:将WT和YZ-7刚放散的壳孢子分别倒入五个小号培养皿(φ=6cm)中,正常盐度(26)下静置培养24h后统计每个培养皿中单个视野的壳孢子平均数(30个视野,10×)(王华芝等,2012),然后将附有壳孢子的培养皿分别换入五种盐度为 26、15、8、5和3的培养液中进行培养,并将盛有壳孢子的小号培养皿放入中号培养皿(φ=9cm),再将两者一起放入已盛有一定蒸馏水的大号培养皿(φ=12cm)中,以减少因培养液水分蒸发而引起的盐度增加,光量子通量密度为 40µmol photons/(m2·s),其它培养条件同 1.2.1,每隔 3d更换一次培养液,并观察壳孢子的存活及分裂情况,培养 7d后,统计壳孢子的假根发生率。
叶状体的耐低盐性测试:随机选取在正常盐度下(26)培养 35d的WT和YZ-7叶状体各 50棵(体长4—7cm),每10棵为一组置于培养瓶内,分别在五种不同盐度(26、15、8、5和 3)培养液中充气培养,每隔5d更换一次培养液,并测量一次叶状体的长度。
1.2.3WT和YZ-7的F1叶状体的特性分析 叶绿素荧光活性的测定:取正常盐度(26)下培养 35d的WT和YZ-7叶状体(每个品系各25棵),各分成5组,分别在26、15、8、5、3盐度下再培养5d,培养条件同 1.2.1,采用超便携式调制叶绿素荧光仪 Mini-PAM(Walz,Effeltrich,Germany)测定叶绿素荧光参数,包括 PSⅡ最大光量子产量(Fv/Fm)和实际光量子产量(Yield),测量时将光纤探头垂直置于藻体表面,Fv/Fm和Yield值分别按以下公式计算求得(姚春燕等,201l):
公式中F0是样品经暗适应15min后,提供约0.3µmol photons/(m2·s)的测量光测得的最小荧光值;Fm是获得F0后再提供 0.8s、4000µmol photons/(m2·s)的饱和脉冲后所测得的最大荧光值;Ft是使用0.3µmol photons/(m2·s)的红光和 40µmol photons/(m2·s)的活化光后测得的样品当前稳态荧光值;Fm'是达到稳态时再施加0.8s、4000µmol photons/(m2·s)的饱和脉冲后测得的样品最大荧光值(张守仁,1999)。
光合色素及蛋白的测定:取正常盐度(26)下培养35d的WT和YZ-7叶状体(每个品系各25棵),各分成5组,分别放在不同盐度26、15、8、5、3下再培养15d,培养条件同 1.2.1,测定叶状体的活体吸收光谱和叶绿素a(chla)、藻红蛋白(phycoerythrin,PE)和藻蓝蛋白(phycocyanin,PC)的含量。叶状体的活体吸收光谱和chla含量的测定方法同Aruga等(1984),PE和PC含量的测定方法同高洪峰(1993)。
如图2a所示,在盐度8条件下培养15d后,WT圆盘体颜色加深,变厚,略有卷曲,长轴和短轴的长度之比接近1︰1,生长基本停滞;YZ-7圆盘体颜色略有加深,由浅红色转变为暗红色,表面略有色泽,无卷曲,长轴明显长于短轴,生长较快。另外,YZ-7圆盘体的面积明显大于WT。据此初步判定YZ-7叶状体具有一定的耐低盐特性。
壳孢子的存活、分裂及假根萌发等情况能反映壳孢子和壳孢子萌发体的低盐耐受能力。在不同盐度下培养2周的YZ-7和WT的壳孢子,在26盐度组存活率无显著差异;在15盐度组,YZ-7的壳孢子存活率和假根发生率分别比WT提高了34%和35%;在8和5盐度组,YZ-7的壳孢子存活率、分裂率及假根发生率分别比WT提高了65%、32%和62%,以及137%、80%和154%;在3盐度组,YZ-7的壳孢子存活率和分裂率分别比WT提高了458%和171%。具体结果如表1所示:YZ-7壳孢子在26、15、8、5和3盐度下培养 2周,其存活率分别为 89.0%、87.0%、75.2%、38.6%和 29.0%,而WT壳孢子的存活率非常低,分别为79.9%、64.9%、45.5%、16.3%和5.2%,各盐度组YZ-7壳孢子的存活率分别为WT的1.1、1.3、1.7、2.4和5.6倍,尤其是8、5和3这三个低盐度组,YZ-7壳孢子的存活率极显著地高于WT(P<0.01)。培养2周后,这三个低盐度组中WT壳孢子的分裂率也很低,分别只有72.6%、50.9%和32.8%;而YZ-7壳孢子的分裂率则分别为95.7%、91.6%和89.0%,两者差异为极显著(P<0.01);在26和15盐度组中,YZ-7和WT壳孢子的分裂率都很高,分别为100%、100%和100%、95.9%,两者没有差异。WT壳孢子在15、8、5和3盐度下培养1周时的假根萌发率分别为67.4%、45.7%、21.6%和 0%,远低于正常盐度(26)组的假根萌发率(85.3%),而YZ-7壳孢子在各盐度下的假根萌发率则分别为90.7%、74.1%、54.9%和 44.9%,也低于正常盐度组(90.9%),但均高于WT且降低的幅度小于WT。在低盐条件下,二者之间呈现显著性差异。在盐度3这个极端低盐度下,WT壳孢子的假根基本不萌发,而YZ-7仍有44.9%的壳孢子能萌发出假根。
表1 不同盐度下坛紫菜野生品系(WT)和选育品系(YZ-7)的壳孢子成活率和分裂率(14d)以及壳孢子苗的假根发生率(7d)Tab.1 Survival anddivision rates of conchospores(14d) and rhizoid germination rates of conchosporegermlings(7d) of the wild-type strain(WT) and the improvedstrain(YZ-7) in P.haitanensiscultured at different salinities
图1 不同盐度下培养的坛紫菜野生品系(WT)和选育品系(YZ-7)的壳孢子萌发体Fig.1 The conchospore germlings of the wild-type strain(WT) and the improved strain(YZ-7) in Pyropia haitanensis cultured atdifferent salinities
从图1a—e可以看出,培养1周的WT壳孢子及萌发体,与正常26盐度组相比,15盐度组的细胞分裂变慢,8盐度组的细胞分裂速度显著下降,色素体颜色变淡,5盐度组的细胞分裂十分缓慢,大部分壳孢子的假根无法形成,3盐度组的壳孢子细胞基本不分裂,也无法形成假根。但是,在各盐度下培养1周的YZ-7壳孢子及萌发体,细胞分裂及其色素体颜色正常,假根能正常形成和固着(图1f—j)。
从图1k—o可以看出,培养2周后,26盐度组的WT壳孢子萌发体颜色鲜艳、有光泽、形状规则、细胞排列均匀、星状色素体清晰可见;15盐度组的壳孢子苗的假根处细胞色素体收缩、部分细胞排列不均匀;8盐度组的壳孢子苗颜色加深、光泽差、苗体畸形、大部分细胞变小且色素体明显收缩、部分假根细胞死亡;5和3盐度组的壳孢子苗颜色更深,无光泽、无假根、基部细胞全部死亡、只剩少量稍部细胞、苗体畸形。同样的培养条件和时间下,各盐度组YZ-7壳孢子萌发体的生长明显优于WT,其中 5盐度组的壳孢子萌发体颜色逐渐加深、部分细胞堆叠;3盐度组的壳孢子苗颜色更深、色素体收缩、假根腐烂且基部细胞部分死亡(图1p—t)。
将正常盐度下培养35d的WT和YZ-7叶状体转入 26、15、8、5、3等五种盐度下继续培养30d,结果发现:在各个盐度条件下,YZ-7叶状体的特定生长率和绝对生长率均大于WT叶状体(表2)。YZ-7叶状体 30d内的特定生长率分别为 9.65%/d、9.65%/d、6.80%/d、5.80%/d和 5.08%/d,而WT叶状体的为5.60%/d、4.98 %/d、4.59%/d、3.57%/d 和 3.23%/d,YZ-7叶状体的特定生长率分别为WT的1.7、1.9、1.5、1.6和 1.6倍。YZ-7叶状体 30d内的绝对生长率分别为2.11 cm/d、2.01 cm/d、0.78 cm/d、0.55 cm/d 和 0.37 cm/d,而WT叶状体的为0.62 cm/d、0.49 cm/d、0.43 cm/d、0.28 cm/d和0.23 cm/d,YZ-7叶状体的绝对生长率分别是WT的3.4、4.1、1.8、2.0和1.6倍。另外,两个品系叶状体的特定生长率随盐度的下降而下降,其中WT的下降幅度较YZ-7明显(表2),说明盐度降低对于YZ-7的影响要小于WT的叶状体。YZ-7叶状体在各盐度组的生长均明显快于WT,其平均体长分别为WT的2.9、3.4、1.6、1.7和1.4倍。在不同盐度下培养15d后,15盐度组YZ-7叶状体的生长率开始高于26盐度组;培养30d后,两组叶状体的平均体长接近,35d后15盐度组开始长于26盐度组并一直保持;而同样条件下26盐度组的WT叶状体30d时的长度是15盐度组的1.2倍。培养5d后,各盐度组的WT叶状体开始成熟;从图2b—c可以看出,培养25d后,26和15盐度组的WT叶状体稍部成熟细胞脱落,藻体发白,基部细胞仍呈浅绿色,藻体色泽好,有弹性;而在盐度8、5和3三个低盐组中,从图2d—f可以看出,藻体颜色加深、发黄、变厚、无光泽、无弹性。从图2g—k可以看出,随着盐度的降低,YZ-7叶状体的颜色也会加深,8、5和3三个低盐组下培养25d,藻体颜色仍鲜艳,有光泽,仍具有较好的弹性。
表2 不同盐度下坛紫菜野生品系(WT)和选育品系(YZ-7)叶状体的生长率Tab.2 The blades growth rates of the wild-type strain(WT) and the improved strain(YZ-7) in P.haitanensis cultured at different salinities
WT和YZ-7幼苗在26盐度下培养35d后,再在26、15、8、5和 3盐度下培养 5d,叶绿素荧光参数的测定结果表明:两个品系的Yield值均随盐度的降低而下降,YZ-7分别降至初始值的96%、94%、84%、75%和60%,WT的下降幅度大于YZ-7,分别降为初始值的 91%、67%、64%、59%和 50%(表3);与 Yield值变化规律不同的是,YZ-7和WT的Fv/Fm值在26、15和8盐度组下无显著下降,而在5和3盐度组中下降明显,分别为初始值的89%、76%和83%、60%(表4)。不论是Yield还是Fv/Fm,YZ-7的值均大于对应组的WT,且在不同盐度下胁迫5d后,YZ-7各参数值的下降幅度均小于WT。
图2 不同盐度下坛紫菜野生品系(WT)和选育品系(YZ-7)叶状体圆盘及叶状体幼苗的生长情况Fig.2 Growth of blade discs from the 40d aged blades of the wild-type strain(WT) and the improved strain(YZ-7) in P.haitanensis and the 35d aged F1 gametophytic blades cultured at different salinities
表3 坛紫菜野生品系(WT)和选育品系(YZ-7)在正常盐度26下培养35d的幼苗再在不同盐度下培养5d后的实际光量子产量Tab.3 Actual quantum yield of photosystem Ⅱ of the blades of wild-type strain(WT) and improved strain(YZ-7) in P.haitanensis cultured at different salinities for 5 days after cultured at the normal salinity of 26 for 35 days
表4 坛紫菜野生品系(WT)和选育品系(YZ-7)在正常盐度26下培养35d的幼苗再在不同盐度下培养5d后的最大光量子产量Tab.4 Maximum quantum yield of photosystemⅡof the blades of wild-type strain(WT) and improved strain(YZ-7) in P.haitanensis cultured at different salinities for 5 days after cultured at the normal salinity of 26 for 35 days
WT和YZ-7幼苗在正常盐度(26)下培养 35d后,再在26、15、8、5和3盐度下培养15d,各组叶状体的活体吸收光谱在波长350—750nm均存在五个明显的吸收高峰,与在正常盐度下培养的叶状体一样;另外,各峰值所处的波长也与正常盐度下相同,但是五个吸收峰的峰值均为低盐组高于高盐组,而且随着盐度的降低,各吸收峰的峰值均呈上升趋势。如图3a所示:WT叶状体在26和15盐度组的吸收峰值较低,8盐度组峰值开始急剧上升,5、3两个低盐组的峰值依次上升,无任何杂峰;如图3b所示:YZ-7叶状体在26和15盐度组的峰值较高,8盐度组的峰值有一定的上升,但不明显;与WT不同的是,15盐度组下YZ-7的峰值略低于26盐度组。
图3 坛紫菜野生品系(WT,a)和选育品系(YZ-7,b)叶状体在正常盐度26下培养35d后再在不同盐度下培养15d后的活体吸收光谱Fig.3 In vivo absorption spectra of gametophytic blades of wild-type strain(WT,a) and improved strain(YZ-7,b) in P.haitanensis cultured at 26 for 35 days and cultured at different salinities for another 15 days
WT和YZ-7的PE和PC含量均随盐度的下降而升高,而chla含量随盐度的下降而下降;YZ-7各盐度组的chla、PE和PC含量均高于WT,且总藻胆蛋白含量与WT相比均呈显著性差异。另外,与WT不同的是,15盐度组YZ-7的总藻胆蛋白含量低于26盐度组,但差异不显著(表5)。
坛紫菜是一种生活在潮间带的海藻,在有淡水流入的海域生长较好(黄海水产研究所紫菜组,1979;福建省水产局,1979)。但是,对于野生坛紫菜的耐低盐性没有一个定量和定性的观察和分析。本研究发现坛紫菜野生品系对盐度变化表现较为敏感,当培养盐度降至 8及以下时,其壳孢子存活率显著下降。严兴洪等(1993a)研究发现,当盐度低于19.6时条斑紫菜野生品系叶状体的营养细胞存活率显著降低。低盐下存活的壳孢子萌发体中大部分只有 1—2个细胞,且无极性的分化,可能是低盐导致已经分裂的一部分细胞因吸水膨胀而破裂,造成分裂率急剧下降。严兴洪等(2008a)研究也发现坛紫菜野生品系的体细胞在8盐度下培养6d后开始吸水膨胀,细胞内色素体以外的空隙明显增大。本研究发现突变品系YZ-7的壳孢子在8盐度下仍有75.2%能正常生长,其中 95.7%的壳孢子能正常分裂,可能是藻体通过改变液泡内的离子浓度进行渗透压调节,以适应外界环境的变化,具体原因有待进一步研究。
表5 坛紫菜野生品系(WT)和选育品系(YZ-7)在正常盐度26下培养35d的幼苗再在不同盐度下培养5d后的主要光合色素含量变化Tab.5 Contents of major photosynthetic pigments of the blades of wild-type strain(WT) and improved strain(YZ-7) in P.haitanensis cultured at different salinities for 5 days after cultured at the normal salinity of 26 for 35 days
紫菜的假根来源于壳孢子第一次细胞分裂时产生的两个极性细胞之一,假根的发生和发育直接决定了藻体能否牢固附着,生活下去。汪文俊等(2009)研究海带假根发育时发现只有孢子体尽快分化出发达假根,才能附着牢固,使植株不在风浪和水流等外力的冲击下脱离基质;严兴洪等(1993b)研究也发现当盐度低于 26.8时坛紫菜体细胞苗的假根形成受到抑制。本实验结果也表明,低盐会直接抑制坛紫菜壳孢子的假根形成,在5盐度组,WT壳孢子的正常假根发生率只有正常盐度组的 25.3%,3盐度组下假根基本不萌发。如果在刚下过暴雨或在低盐度的海区进行坛紫菜野生品系壳孢子的海上采苗工作,有可能导致壳孢子因假根无法正常萌发,附网不牢而流失,影响产量。选育品系YZ-7壳孢子在5盐度下的正常假根发生率高,是WT的 2.5倍,在 3盐度组,仍有44.9%的壳孢子假根正常发育,说明它有较强的耐低盐特性。
Fv/Fm是PSⅡ最大光化学量子产量的值,反映了PSⅡ原初光能转化效率,非胁迫条件下该参数的变化极小;Yield反映了当PSⅡ反应中心部分关闭情况下的实际原初光能捕获效率,由叶片不经过暗适应在光下直接测得(张守仁,1999)。本研究发现,在正常盐度下YZ-7品系的Fv/Fm和Yield均高于WT品系,说明该YZ-7叶状体在正常盐度下光合效率更高,生长更快。而随着盐度的下降,WT叶状体的Fv/Fm和Yield均逐渐下降,特别是在3盐度组,分别只有初始值的60%和 50%,说明低盐胁迫可能对 PSⅡ产生了伤害,使 PSⅡ的光化学活性及能量转换率下降。饶本强等(2010)发现盐胁迫导致集球藻的生物量和光合活性明显下降;陈兰周等(2003)也发现盐胁迫显著抑制了爪哇伪枝藻(Scytonema javanicum)的生长和光合活性,梁英等(2006)研究发现盐胁迫能对塔胞藻 PSⅡ产生伤害。与WT不同,YZ-7叶状体在8盐度条件下胁迫处理5d后,Fv/Fm保持不变,说明YZ-7品系在8盐度下基本不受胁迫或受胁迫较小。由于藻类对盐度变化响应的机制十分复杂,仅从某一个方面去研究是远远不够的,还有待于进一步研究。
Chla、PE和PC是坛紫菜的主要光合色素和色素蛋白,其含量高低是衡量商品干紫菜品质的重要指标(董宏坡等,2004)。在正常盐度下,YZ-7活体吸收光谱吸收峰值以及chla、PE和PC的含量均高于WT,这应该是YZ-7在正常盐度下生长更快的原因之一。但随着盐度降低,WT叶状体的PE和PC含量都逐渐升高,而 chla含量却逐渐下降,说明低盐胁迫使chla的合成受到抑制(张志刚等,2010),也可能是低盐胁迫下捕光色素蛋白复合体和反应中心复合体受损伤或部分降解而导致的(梁英等,2006)。与WT不同,YZ-7叶状体在15盐度组下其PE和PC含量低于26盐度组,可能是因为YZ-7经γ射线诱变后最适盐度发生了改变,其详细的机理还有待于进一步的研究。
从叶状体的低盐耐受性结果来看,野生品系的幼叶状体(35d)在三个低盐组下生长缓慢,在 8盐度培养 30d,体长只增加了 4倍,藻体的颜色变黄、变厚、无光泽,在5和3盐度下没有出现腐烂、卷曲现象,说明低盐对叶状体细胞分裂的影响较大,但是壳孢子在极低盐度下死亡率较高,可能是因为叶状体外面有胶质层的保护,而壳孢子外没有胶质层,容易受到低渗的影响而吸水涨破。相同条件下,YZ-7叶状体增长了7.6倍,生长优势与WT相比极为明显,藻体颜色鲜艳、有光泽,显示出很强的耐低盐性。本研究结果说明YZ-7品系在耐低盐性、藻体的颜色、光合色素含量、生长速度等方面均明显优于WT品系,有望应用于栽培并被培育成耐低盐的紫菜良种。
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