生物共代谢法降解石油污染土壤中的萘、菲*

生物共代谢法降解石油污染土壤中的萘、菲*

杨智临 陈海 白智勇 李博 杨琦

中国地质大学（北京）水资源与环境学院

利用从石油污染土壤中筛选分离出的专一性降解萘菌株Rhodococcus（红球菌属）与菲菌株Nocardioides（类诺卡氏菌属）对萘、菲进行共代谢降解研究。以菲为共代谢基质萘降解菌降解萘的最佳菲初始投加量为0.064mg/L，最佳温度为35℃；以萘为共代谢基质菲降解菌降解菲的最佳萘初始投加量为7.16mg/L，最佳降解温度为25℃。在本实验范围内以菲为共代谢基质萘降解菌降解萘的最高去除率达到86%；以萘为共代谢基质菲降解菌降解菲的最高去除率为42%。

共代谢；萘；菲；实验；降解

随着工业的发展，萘、菲造成的环境污染问题也越发明显，其中，萘在油田污水中广泛存在，是油田污水的特征污染物之一，某油田石油污水中曾检出多达数十种萘及萘系化合物。菲比萘有更强的毒性，近年来在环境和生物体内的检出率非常高。利用从石油污染土壤中筛选分离出的专一性降解萘菌株Rhodococcus（红球菌属）与菲菌株Nocardioides（类诺卡氏菌属）对萘、菲进行共代谢降解研究。

1 实验材料与方法

1.1 试验试剂与仪器

仪器：立式自动电热压力蒸汽灭菌锅，洁净工作台，恒温水浴振荡器，分光光度计，高速冷冻离心机，液相色谱仪等。

材料试剂：萘、菲（J&KCHEMICA）、牛肉膏、蛋白胨等。

1.2 萘、菲的检测方法

萘、菲浓度以高效液相色谱测定，色谱柱为C—18反相色谱柱，λ=254nm，流动相为甲醇∶水=90∶10，流速为1.0mL/min，进样量为20μL。

1.3 萘、菲降解菌的富集培养

将从石油污染土壤中筛选出的萘（菲）降解菌接种于灭菌后的无机盐培养液中，添加一定量的固体萘（菲）作为唯一碳源，接种后将锥形瓶放入温度为30℃的恒温振荡器中进行培养。

1.4 萘、菲互为共代谢基质的降解实验

降解实验在250mL血清瓶中进行，取218mL灭菌后的无机盐溶液倒入血清瓶中，并分别加入不同量的萘、菲，迅速将瓶塞塞上，用封口膜封住，摇匀，放入水浴振荡器12h并混匀。

2 实验结果与分析

2.1 以菲为共代谢基质降解萘菌对萘的降解

（1）不同浓度菲共代谢基质下降解萘菌对同一浓度萘的降解。初始条件：萘的初始浓度为7mg/L，温度为30℃，初始值pH值为7，菌悬液接种量为1%，转速为150r/min。从不同菲基质浓度下萘降解菌对同一浓度萘的降解曲线可看出，在0.064mg/L时，菌种对萘的去除效果最好，去除率为67%；而在浓度为0.1～0.6mg/L之间菌种对萘的去除略差，对萘的去除率约为60%，从总体上来讲，菲的加入抑制了菌种对萘的降解。

（2）以菲为共代谢基质在不同温度条件下降解萘菌对同一浓度萘的降解。初始条件：萘的初始浓度为7mg/L，pH值为7，菲的初始浓度为0.1mg/L，菌悬液接种量为1%，转速为150r/min。从以菲为共代谢基质、在不同温度条件下降解萘菌对同一浓度萘的降解曲线可看出，随温度的升高，菌种对萘的降解效果逐渐明显，说明在一定的范围内，温度的升高对细菌体内酶的活性有提高作用，加快了降解萘的反应过程；在35℃时降解效果最好，去除率为61%。

2.2 以萘为共代谢基质降解菲菌对菲的降解

（1）不同浓度萘共代谢基质下降解菲菌对同一浓度菲的降解。初始条件：菲的初始浓度为0.55mg/L，温度为30℃，初始pH值为7，菌悬液接种量为1%，转速为150r/min。从不同萘基质浓度下降解菲菌对同一浓度菲的降解曲线可看出，随着萘的浓度升高，菌种对菲的降解程度呈现变大趋势，这说明萘的加入对菌种降解菲有一定的促进作用；在萘的浓度为7.16mg/L时，菌种对菲的降解达到了最大值，去除率为43%。

（2）以萘为共代谢基质在不同温度条件下降解菲菌对同一浓度菲的降解。初始条件：菲的初始浓度为0.55mg/L，pH值为7，萘的初始浓度为7mg/L，菌悬液接种量为1%，转速为150r/min。从以萘为共代谢基质、在不同温度条件下降解菲菌对同一浓度菲的降解曲线可看出，在30℃时菌种对菲的降解效果最差，对菲去除率为22%；而在35℃时，降解效果最好，对菲的去除率为42%。

3 菌种的生长曲线分析

准备两个锥形瓶，向锥形瓶内分别接种1%的萘降解菌株和菲降解菌株，然后萘、菲混合后分别向两个锥形瓶中投加足够量以提供碳源，在30℃、150r/min摇床上培养，定时对菌株的生长进行检测，利用OD600来表征菌量的多少。

从萘、菲共同作为碳源降解萘菌、菲菌的生长曲线可以看出，两株菌的生长均有明显的对数增殖期（减速增殖期）、稳定期、内源呼吸期；另外，与单独碳源相比，此时的细菌生长开始的适应期较明显，说明在萘、菲两种碳源加入后，细菌对培养基的适应需要一段时间；与菲菌的生长不同的是，萘菌生长的增殖期两段比较明显，前10天细菌生长速度比较快，后10天细菌也在生长，但生长速率比前10天略小；基本上在40天的时候，两株菌的菌量都在减少，到60天时趋于稳定。

4 结论

（1）以菲为共代谢基质萘降解菌降解萘的最佳菲初始投加量为0.064mg/L，最佳温度为35℃；以萘为共代谢基质菲降解菌降解菲的最佳萘初始投加量为7.16mg/L，最佳降解温度为25℃。

（2）在本实验范围内以菲为共代谢基质萘降解菌降解萘的最高去除率达到86%；以萘为共代谢基质菲降解菌降解菲的最高去除率为42%。

（3）在萘、菲互相共代谢条件下两种菌株的生长都有明显的对数增殖期（减速增殖期）、稳定期、内源呼吸期，与单独碳源条件下相比，此时细菌生长的适应期明显。

（栏目主持 杨军）

10.3969/j.issn.1006-6896.2014.11.024

基金论文：重点防控重金属汞、铬、铅、镉、砷便携/车载/在线监测仪器开发与应用示范（2012YQ060115）；中央高校基本科研业务费专项资金资助（2652013101，2652013086，2652013087）。