HPLC法同时测定镇惊泻火颗粒中4种成分的含量Δ

许丽雯，奚之骏（上海中医药大学附属龙华医院，上海 200032）

镇惊泻火颗粒为上海中医药大学附属龙华医院研制开发的中药复方制剂，由甘草、淮小麦、大枣、知母、大黄等药味组成，临床用于治疗抑郁症、广泛性焦虑和精神障碍等多种精神、情志疾病[1-3]。为更全面地控制产品质量，本试验采用高效液相色谱（HPLC）法测定了方中芒果苷、芦荟大黄素、大黄素和大黄酚的含量。

1 材料

1.1 仪器

1260型HPLC仪，包括G1311B型四元泵、G1329B型自动进样器、G1316A 型柱温箱、G1314F 型可变波长检测器（美国Agilent 公司）；DL-120D 型智能超声波清洗器（上海之信仪器有限公司）；AG135型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 药品与试剂

镇惊泻火颗粒（龙华医院院内制剂，批号：20120615、20120712、20120726）；芒果苷、芦荟大黄素、大黄素和大黄酚对照品（中国食品药品检定研究院，批号分别为111607-200402、110795-201007、110756-200110、110796-201118）；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Capcell Pak C18（250mm×4.6mm，5μm）；预柱：Phenomenex C18（4.0mm×3.0mm，5μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～30min，10%→27%A；＞30～40min，27%→55%A；＞40～60min，55%→90%A）；检测波长：254nm；流速：1.0ml/min；柱温：20℃；进样量：10μl。

2.2 混合对照品贮备液的制备

取经五氧化二磷干燥48h后的芒果苷、芦荟大黄素、大黄素和大黄酚对照品各适量，精密称定，用甲醇配制成质量浓度分别为101.8、20.16、10.72、10.24µg/ml，即得混合对照品贮备液。

2.3 供试品溶液的制备

取镇惊泻火颗粒约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定质量，超声（功率：120W，频率：40kHz）处理30min，放冷，再次精密称定，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，续滤液经0.45μm微孔滤膜滤过，即得。

2.4 阴性样品溶液的制备

按处方量分别制备缺知母和大黄的阴性样品，按“2.3”项下方法制备阴性样品溶液。

2.5 系统适用性试验

分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照样品溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定。结果表明，芒果苷、芦荟大黄素、大黄素和大黄酚与样品中其他组分色谱峰可达基线分离，分离度＞1.5；所测成分理论板数均不低于10000；阴性样品无干扰。色谱见图1。

2.6 线性关系考察

精密吸取“2.2”项下混合对照品贮备液1.00、2.50、5.00、7.50ml，分别置于10ml 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，得不同质量浓度的混合对照品溶液。取混合对照品溶液和“2.2”项下混合对照品贮备液各适量，按上述色谱条件进样测定，记录峰面积。以混合对照品溶液的质量浓度（x，µg/ml）为横坐标，峰面积积分值（y）为纵坐标，进行线性回归，得回归方程，结果见表1。

图1 高效液相色谱图A.混合对照品；B.供试品；C.知母阴性对照；D.大黄阴性对照样；1.芒果苷；2.芦荟大黄素；3.大黄素；4.大黄酚Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed control；B.test sample；C.Anemarrhena asphodeloides negative control；D.Rheum palmatum negative control；1.mangiferin；2.aloe-emodin；3.emodin；4.chrysophanol

表1 线性关系考察结果（n＝4）Tab 1 Linearing relationship（n＝4）

2.7 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液10μl，按上述色谱条件连续进样6次，测定峰面积。结果，芒果苷、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚的RSD 分别为0.71%、0.65%、0.73%、0.89%（n均为6），表明仪器精密度良好。

2.8 重复性试验

取“2.3”项下的同一批（批号：20120615）供试品溶液适量，按上述色谱条件进样测定，记录峰面积，计算样品含量。结果，芒果苷、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚的平均含量分别为1.1170、0.2153、0.0846、0.0827mg/g，RSD 分别为1.30%、0.97%、1.10%、1.40%（n均为6），表明本方法重复性良好。

2.9 稳定性试验

取“2.3”项下的同一批（批号：20120615）供试品溶液适量，室温下放置，按上述色谱条件分别于0、2、4、8、12、24h进样测定，记录峰面积，计算样品含量。结果，芒果苷、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚的平均含量分别为1.1090、0.2141、0.0839、0.0833mg/g，RSD 分别为0.78%、0.92%、0.89%、1.10%（n均为6），表明供试品溶液在24h内基本稳定。

2.10 加样回收率试验

取已知质量分数的同一批（批号：20120615）样品6份，每份约0.5g，精密称定，分别加入一定量的混合对照品溶液（芒果苷、芦荟大黄素、大黄素和大黄酚的质量浓度分别为0.5645、0.1157、0.0487、0.0434mg/ml），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进样测定，计算加样回收率，结果见表2。

表2 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 2 Results of recovery tests（n＝6）

2.11 样品含量测定

取3个批次的镇惊泻火颗粒各适量，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液适量，按上述色谱条件进样测定，记录峰面积，按双点校正法计算各成分含量，样品含量测定结果见表3。

表3 样品含量测定结果（mg/g，n＝3）Tab 3 Results of content determination of samples（mg/g，n＝3）

3 讨论

3.1 流动相的选择

文献中芒果苷的分离多用乙腈-0.2%冰醋酸溶液、乙腈-0.5%磷酸水溶液、乙腈-33mmol/L 磷酸二氢钾溶液、甲醇-0.4%冰醋酸水溶液等流动相体系[4-7]；分离大黄蒽醌苷元则多用甲醇-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.2%磷酸水溶液体系[8-10]。本试验参考上述条件进行分离，结果均不理想；后采用乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相并作梯度洗脱，各成分的峰形和柱效有明显改善，所测成分得到了良好的分离。

3.2 提取溶剂的选择

在预试验中，分别采用60%、80%、100%甲醇作为提取溶剂，比较各成分的提取率，结果显示，100%甲醇的提取率较高，故选择其为提取溶剂。

3.3 检测波长的选择

芒果苷、芦荟大黄素、大黄素和大黄酚在254nm 波长处均有较大吸收，可保证定量的准确性，故选择254nm 为检测波长。

综上所述，本方法准确、稳定、重复性好，可用于镇惊泻火颗粒的质量控制。

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