乌头根际土壤细菌群落多样性的PCR-DGGE分析

吴清华，王光志，马云桐，裴瑾，康亚兰

·品种品质·

乌头根际土壤细菌群落多样性的PCR-DGGE分析

吴清华，王光志，马云桐，裴瑾，康亚兰

目的：研究不同生长期乌头根际土壤微生物细菌群落结构的差异。方法：采用PCR-DGGE技术，研究不同产地不同健康状况的乌头根际土壤细菌群落结构的变化。结果：健康与患病乌头根际土壤细菌群落结构存在差异性，且患病植株具有能引起植物患病的病原种。结论：患病植株改变了乌头根际土壤的微生物细菌群落多样性，致病菌的存在导致了乌头植株的患病。根际土壤的健康状况对土壤微生物群落结构有显著影响，根际微生物群落结构的不同将导致植物对病原菌的抗性及品种差异。

乌头；细菌；PCR-DGGE；群落结构

乌头Aconitum carmichaeli Debx.为毛茛科植物，子根附子为著名的川产道地药材，其性热、味辛，有毒，具有回阳救逆，补火助阳，祛风散寒等功效，在四川彰明、江油等地栽培已有近千年的历史。早在《神农本草经》中已有记载，乌头为散寒止痛要药，被列为攻治疾病的重要药物。但是乌头在栽培过程中，病害时有发生，且严重影响到附子的产量和品质。

土壤是人类生存和发展的物质基础，与人类息息相关。土壤为各种生物及微生物提供生存空间，而土壤微生物是土壤形成和营养元素循环的主题，它参与有机质的分解、腐殖质的形成、养分转化和循环等多个过程[1,2]；同时也是转化植物养料、代谢有机物质和降解污物的驱动力，在土壤肥力和生态系统中具有重要的作用[3～5]。根际区是植物体与土壤物质、能量交换的场所，植物根际土壤微生物功能的差异会对植物所需营养物质的提供产生影响，而这些物质的供给又将会影响到植物之间的竞争[6]。已有实验证明，在植物种间高度竞争的多培养条件下，土壤微生物对植物生长具有强烈的影响[7]。其中，有益和有害微生物相互拮抗，有害菌一旦占据统治地位，土壤的内在平衡被打破，很容易发生土传病害。有些根际土壤微生物甚至能够引起植物发病。

土壤细菌是土壤微生物的一个重要组成部分，其数量的变化对土壤养分和植物的生长产生了重要的影响，因为土壤中细菌无论在分解有机质、促进植物生长，还是在植物病害生物防治方面都发挥着比真菌更大的作用[8]。由于土壤中可培养的微生物不到1%，故传统的培养分离方法在对微生物群落结构的多样性方面存在着很大的局限性，不能客观的反应样品信息，从而导致微生物群落大量信息的流失。近几十年来，随着分子生物技术的不断发展，特别是PCR-DGGE的广泛应用，使得微生物群落多样性分析得到一个很大的改善和提高，人们对微生物群落结构也有更全面的认识。本研究以乌头道地产地江油根际土壤为研究对象，选取2012年2、3月份健康与患病土样，探讨不同产地健康与患病乌头根际土壤细菌的差异，为揭示乌头健康与患病植株根际土壤的微生物多样性的差异，保证乌头的健康发展提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 材料

选取四川省江油市太平镇、青莲镇、九岭镇、三合镇、彰明镇5个产区。于2011年3-5月间每月中旬分别采集健康与患病植株根区5-10cm的土壤样品。参照《农田土壤环境质量检测技术规范》NY/ T395-2000方法，按S形布点采样，每个点按健康与患病植株分别进行多点混合，混匀后经四分法取1kg左右保留备用。将土壤置于保鲜袋，记录样品信息后带回实验室，去除土壤中的动植物残体等杂质，将新鲜土壤样品用于DNA的提取。

1.2 方法

1.2.1 土壤总DNA的提取 按照土壤提取试剂盒（OMEGA）操作步骤进行总DNA的提取，并对提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳的检测。

1.2.2 基因组DNA的PCR扩增 PCR扩增引物采用细菌通用引物对R518/F357-GC扩增16SrDNA基因V-3区。

土壤DNA扩增16SrDNA基因V-3区扩增引物：F357:5`-TAC GGG AGG CAG CAG-3`

R518:5`-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3`

GC-F357:5`-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGGG TAC GGG AGG CAG CAG-3`

降落PCR反应参数：94℃变性5min；94℃变性1min，58℃1min，72℃40s，35个循环；72℃延伸10min。

1.2.3 DGGE检测 采用Bio-Rad Laboratories Inc对PCR扩增产物进行DGGE分析。采用10%的聚丙烯酰胺制备梯度为30%～65%的变性剂。PCR产物每孔加样15µL，在恒温60℃，120V电泳300min[9]。电泳结束后，对凝胶进行银染显色，拍照。切胶回收目的条带DNA，进行第二次PCR扩增，最后将扩增PCR产物委托大连宝生物有限公司测序。

将测序所得序列在NCBI的Blast程序进行序列比对，并将所测细菌序列采用Sequence进行提交，找出与目的片段相似度高的菌种。

1.2.4 数据统计分析 采用Quantity One软件对DGGE条带进行数字化分析，计算样品中可检测到的DGGE条带数，采用STATA10.0软件进行聚类分析，采用CLUSTALX与MEGA15.0软件对细菌测序菌种作系统进化树分析。

2 结果与分析

2.1 健康与患病乌头细菌DGGE结果

图1 细菌DGGE图谱（一）

图2 细菌DGGE图谱（二）

如图1和图2所示：壤、青莲镇患病土壤、彰明镇患病土壤、九岭镇患病土壤和三合镇患病土壤；11-20号分别为四月份太平镇健康土壤、青莲镇健康土壤、彰明镇健康土壤、九岭镇健康土壤、三合镇健康土壤、太平镇患病土壤、青莲镇患病土壤、彰明镇患病土壤、九岭镇患病土壤和三合镇患病土壤；21-30号分别为五月份太平镇健康土壤、青莲镇健康土壤、彰明镇健康土壤、九岭镇健康土壤、三合镇健康土壤、太平镇患病土壤、青莲镇患病土壤、彰明镇患病土壤、九岭镇患病土壤和三合镇患病土壤。

从图1和图2得到细菌的DGGE电泳图谱，可以看出乌头根际土壤微生物在不同的生长期和健康状况不同的情况下，其微生物多样性也存在着差异；结果也表明选取的细菌DGGE条件能将大部分相同片段的DNA条带分开，该实验条件选取适合。图片可知，乌头患病根际土壤微生物多样性要比健康根际土壤丰富，月份的不同其微生物多样性也存在着差异。

2.2 健康与患病乌头植株根际土壤细菌群落结构的DGGE分析

将切胶回收的20个细菌目的片段DNA在NCBI的Genbank上作核酸序列的Blast比对，找出与该目标细菌片段相似度高的细菌菌种，结果可见表1。

表1 四川江油乌头根际土壤细菌种类

经鉴定结果得出这20个细菌菌种主要来源于4门（绿菌门、拟杆菌门、变形菌门、蓝藻门）3纲（δ-变形菌纲、鞘脂杆菌纲、蓝藻纲）5目（黄色单胞菌目、根瘤菌目、脱硫弧菌目、假单胞菌目、颤藻目）4科（鞘脂杆菌科、丛毛单胞菌科、脱硫弧菌科、假单胞菌科）7属（假单胞菌属、芽孢八叠球菌属、从毛单胞菌属、脱硫弧菌属、鞘脂杆菌属、杆菌属、颤藻属）。体现出了乌头根际土壤微生物细菌群落结构的多样性及丰富性。

3 讨论

本研究采用PCR-DGGE技术对乌头不同产地、不同生长状况及不同月份的根际土壤进行细菌群落的动态变化进行分析。DGGE图谱表明由于生长季节及生长状况的不同，微生物细菌群落的多样性存在较大的差异，但是，他们都存在一个共同点，即乌头的生长状况与细菌的多样性存在着密切关系。生长良好的乌头土壤细菌多样性少于患病乌头土壤细菌，可能是由于患病乌头土壤细菌抑制了正常植株的生长，加快了乌头幼苗的死亡。

根际土壤细菌PCR测序结果表明，患病土壤除具有和健康植株相同的细菌属外，还具有自己独特的菌数如X1，X5。经测序鉴定发现这些独特的DNA片段分别为绿脓杆菌（p.aeruginosa）、果胶杆菌（Pectobacterium carotovorum）。经研究发现，绿脓杆菌是一种常见的病菌，其分布于土壤、空气，水等环境中，致病力较低但抗药性强的病菌；果胶杆菌也是一种能引起黑胫病、细菌性软腐病的致病菌，广泛存在于自然界中。经DGGE研究发现，健康与患病乌头根际土壤在微生物多样性方面具有较高的相似性，而且有大部分细菌是NCBI收录的未培养的物种。

本研究就选取3～5月份乌头根际土壤微生物细菌进行微生物群落的动态变化研究，这也是乌头生长的代表性月份，尤其是到了5月份，大部分患病乌头都被药农除去，故选取还是具有研究意义的。由于微生物种类较多，本研究单一选取细菌来分析并不能代表整个微生物群落的结构，这是本研究的不足之处。在乌头地上部分生长旺盛的3～5月，土壤细菌繁殖也比较旺盛。随着病虫害种类的不断增加和土传病害等因素的影响，患病乌头根际土壤细菌的种类也在增加，从而使乌头根际物质分泌活动降低。在某种层面上乌头细菌种类与根际分泌物存在着很大的关系，但是具体的根际微生物与根系分泌物的协同作用机理尚不明确，还需作进一步的研究，从而为乌头的健康发展提供参考依据。

[1] 唐莉,梁丽娟,叶华智,等.附子常见病害的调查研究[J].现代中药研究与实践,2004,18(6):29.

[2] HanL-M,Yan F,Wang-S-Q,et al.Primary identification of organic compounds in soybean rhizospheric soil on continuous and altermate cropping and their allelopathy on soybean seed germination[J].Chinese Joumal of Applied Ecology, 2000,11(4):582.

[3] Wu F-Z,Men L-Z,Wen J-Z. Effect of root exudates on mycelium growth of cucumber fusarium wilt China Vegetables,2002,(5):26.

[4] Mithofer A. Suppression of plant defence in rhizobia-legume symbiosis Trends in Plant Science, 2002,7(10)Q:440.

[5] Yang CH,Crowley DE,Menge JA. 16S rDNA fingerprinting of rhizosphere bacterial communities associated with healthy and phytophora infected avocadotoots FEMS Microbiology Ecology, 2001,35(2):129.

[6] 关松荫.我国主要土壤剖面酶活性状况[J].土壤学报,1984,21 (4):868.

[7] ZORNOZA R,GUERRERO C, MATAIX-SOLERA J, et al. Assessing air-drying and rewetting pre-treatment effect on some soil enzyme activities under Mediterranean conditions[J]. Soil Biology and Biochemistry,2006,38:2125.

[8] 徐瑞富,王小龙.花生连作田土壤微生物群里动态与土壤养分关系研究[J].花生学报,2003,32(3):19.

[9] Mitali Das,Todd V.Royer,and Laura G.Leff.Diversity of fungi,bacteria,and actinomycetes on leaves decomposing in a stream[J].Applied and environmental microbiology,2007,73(3):756.

（责任编辑: 胡慧玲）

PCR-DGGE analysis of bacterial community diversity in rhizosphere soils of Wutou

WU Qing-hua, WANG Guangzhi, MA Yun-tong, PEI Jin, KANG Ya-lan//(Pharmacy College,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine;The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine;State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, China)

Objective:Study the structural differences of Wutou rhizosphere soil microbial bacterial communities in different growing season.Method:PCR-DGGE technology was applied to research the change of Wutou rhizosphere soil bacterial communities of different habitats and different health status of Wutou.Result:Difference can be detected between Wutou rhizosphere soil bacterial communities of health and illness Wutou, and diseased plants had pathogens which can cause illness of plants.Conclusion:Diseased plants change Wutou rhizosphere soil microbial bacterial communities, and existed pathogens induce the plant disease. The health status of the rhizosphere soil microbial community structure have signifcant impact on the rhizosphere microbial community structure differences which will lead to plant resistance to pathogens and species differences.

Wutou; bacteria; PCR-DGGE; community structure

R 282.5

A

1674-926X(2014)01-002-03

国家自然科学基金项目（No.30901962）

成都中医药大学药学院 中药材标准化教育部重点实验室 中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 611137

吴清华（1986-），女，助教，从事中药品种、质量和资源开发方向研究Tel:13980037435 Email:lingduweixiaoi@sina.cn

王光志（1976-），男，博士，教授，从事中药品质评价与资源利用研究 Email:346211525@qq.com

2013-08-14