猪背最长肌PFK-2/F BPase-2荧光定量RT-PCR方法的建立

李朋颖，汤晓艳*，王 敏，康大成，颜成英

（中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，农业部农产品质量安全重点实验室，北京 100081）

猪背最长肌PFK-2/F BPase-2荧光定量RT-PCR方法的建立

李朋颖，汤晓艳*，王 敏，康大成，颜成英

（中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，农业部农产品质量安全重点实验室，北京 100081）

为研究糖酵解关键酶果糖-6-磷酸-2激酶/果糖-2,6-二磷酸酯酶（6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase，PFK-2/FBPase-2）基因转录水平与宰后肉品质间的关系，根据猪PFK-2/FBPase-2 mRNA序列（GenBank登录号：NM_001143721.1）设计一对特异性引物并选择β-actin作为内参基因，构建含有各自序列的重组质粒标准品，通过对反应条件的优化，建立了荧光定量实时-聚合酶链式反应技术检测猪PFK-2/FBPase-2基因转录水平的方法。结果表明，所建立的方法线性关系好，目的基因与 内参基因R2均大于0.999；灵敏度高，两基因检出下限均为10拷贝/μL；特异性好，扩增产物均有特异性单一峰。同时根据标准曲线计算可知目的基因与内参基因的扩增效率分别为104.5%和104.0%，扩增效率接近一致，可对PFK-2/FBPase-2转录水平进行相对定量。本研究选取PSE肉产生程度不同的三元杂交猪、杜洛克猪和太湖猪，利用建立的方法对不同品种猪宰后45 min背最长肌中PFK-2/FBPase-2 mRNA转录水平进行测定，结果表明，太湖猪转录水平最高、杜洛克次之、三元杂交猪最低，且3 个品种间有显著性差异（P＜0.05）。

猪；PFK-2/FBPase-2 mRNA；SyBR Green I；荧光定量实时-聚合酶链式反应

生猪屠宰后，肌肉组织经过一系列变化过程转化成肉，肌肉pH值从7.0降至5.5左右，肌肉首先变硬变粗，随后变嫩，最终形成具有一定色泽、质地、风味等品质特性的食用肉。研究表明，不同品种猪宰后其肉品质具有一定差异性，同时宰前处理方式也会对最终肉品质造成影响[1]，若品种选择或宰前处理不当则会产生劣质肉，如发白、柔软、多汁性（pale, soft, exudative，PSE）肉。每年由于PSE肉的产生给畜禽产业造成巨大的经济损失。已经知道，宰后无氧糖酵解速度和程度对肉品质形成具有重要影响，无氧糖酵解速度越快，越易产生PSE肉[2]。研究表明，果糖-2,6-磷酸是糖酵解关键酶 磷酸果糖激酶（phosphofructokinase-1，PFK-1）的强力激活因子，其含量水平的升高可促进糖酵解的进行[3-4]，同时果糖-2,6-二磷酸的合成与分解受果糖-6-磷酸-2激酶/果糖-2,6-二磷酸酯酶（6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase，PFK-2/FBPase-2）的调节，因此PFK-2/ FBPase-2是影响能量代谢的关键调控酶，同时也是一个具有激酶和酯酶催化活性的双功能酶[5-7]。

PFK-2/FBPase-2最早发现于大鼠肝脏，其可通过调节果糖-2,6-二磷酸含量来调节细胞中葡萄糖平衡，接着在哺乳动物心脏、睾丸、大脑、肌肉等组织中也有发现，且分子质量及生物活性均存在差别[8]。目前对于PFK-2/FBPase-2的研究主要集中在肿瘤方面，研究发现，与正常组织相比在肿瘤细胞中PFK-2/FBPase-2有较高水平的表达，且有报道称在动物实验中通过抑制PFK-2的表达可以减少肿瘤细胞的生长[9-11]，然而对于PFK-2/ FBPase-2在猪宰后糖酵解过程及在肉品学中的相关研究均未见报道。由于荧光定量实时-聚合酶链式反应（real time-polymerase chain reaction，RT-PCR）与普通PCR相比具有高特异性和高灵敏度，可实现模板的准确定量的特点[12]，且已有人利用该方法对糖酵解有促进作用的PRKAG3基因（编码一磷酸腺苷激活蛋白激酶γ3亚基）与胴体品质关系进行研究，结果表明PRKAG3在猪组织器官中的表达与胴体品质具有相关性[13]，故本研究采用SyBR Green I荧光定量RT-PCR方法，以β-actin作为内参基因，构建质粒标准品，优化反应条件，建立荧光定量RT-PCR技术检测猪PFK-2/FBPase-2转录水平的方法，为进一步研究PFK-2/FBPase-2与宰后猪肉品质的关系提供方法和技术手段。

1 材料与方法

1.1 实验动物

取宰后45 min的6月龄太湖猪、杜洛克猪及三元杂交猪（杜洛克猪×（长白猪×大白猪））背最长肌各约100 mg，置于组织保存液中保存，送至实验室于-20 ℃保存。取宰后45 min太湖猪背最长肌样品用于建立SyBR Green Ⅰ荧光定量RT- PCR方法。

1.2 试剂与仪器

感受态菌株E.coli JM109、pMD18-T Vector、SyBR Premix Ex Taq Ⅱ、100 bp DNA Ladder Marker 宝生物工程（大连）有限公司；Trizol Reagent、SuperScript VILO cDNA合成试剂盒 美国Invitrogen公司；Universal DNA 纯化回收试剂盒、高纯度质粒小提中量试剂盒北京天根生化科技有限公司；RQ1 RNase-Free Dnase（Promega公司）；2×Power Taq PCR Master Mi x 百泰克生物技术有限公司。

EDC-810 PCR扩增仪 东胜创新生物科技有限公司；7500实时荧光定量PCR仪 美国Thermo Scientif i c公司。

1.3 方法

1.3.1 引物设计

根据GenBank中登录的猪PFK-2/FBPase-2 mRNA序列，应用Primer Premier 5.00软件设计一对特异性引物，见表1。β-actin引物序列参考李龙等[14]，其中β-actin引物除进行荧光定量PCR反应外，还可用于PCR鉴定逆转录合成的cDNA的质量。PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 实时荧光PCR引物Table 1 Primers of real-time PCR

1.3.2 总RNA提取与逆转录

将保存于组织保存液中的宰后45 min背最长肌样本液氮研磨后，采用Trizol法提取总RNA，采用RNase-Free DNase消除DNA污染[15]。提取完成后，约1 μg的总RNA用于cDNA第1链的合成，按SuperScript VILO cDNA合成试剂盒说明书进行，反应条件为：25 ℃退火10 min，42 ℃延伸60 min，85 ℃再延伸5 min。反应完成后测定产物浓度，将其质量浓度稀释至约40 ng/μL后，-20 ℃分装保存。

1.3.3 cDNA第一链质量检测

采用内参基因β-actin进行PCR反应检测cDNA质量，25 μL反应体系如下：2×Power Taq PCR Master Mix 12.5 μL，稀释后模板cDNA 1.5 μL，β-actin上游引物1.5 μL，下游引物1.5 μL，焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate，DEPC）处理水8 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，28 个循环；72 ℃再延伸10 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察。

1.3.4 PFK-2/FBPase-2及β-actin质粒标准品的构建

以1.3.2节获得的cDNA为模板，分别扩增PFK-2/ FBPase-2基因与β-actin基因的目的片段，反应条件见1.3.5节。PCR产物经Universal DNA纯化回收试剂盒纯化后克隆至pMD18-T载体并转化感受态菌株E.coli JM109，应用α互补法和氨苄青霉素筛选法筛选阳性转化菌株，并通过PCR反应及序列分析进行验证。提取质粒后测定DNA浓度，以10 倍系列梯度稀释质粒标准品至浓度梯度为10 拷贝/μL。

1.3.5 反应体系的优化及标准曲线的建立

荧光定量P C R总反应体系2 0 μ L：S Y B R Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，10 μmol/L的上、下游引物设计3 个不同终浓度0.2、0.4 μmol/和0.8 μmol/L（相应的添加体积为0.4、0.8 μL及1.6 μL），ROX Reference Dye 0.4 μL，质粒模板 2 μL，ddH2O补足至终体积 20 μL。反应条件为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火，设计不同退火时间（34、47、60 s），40 个循环，经荧光定量PCR仪检测后，以各稀释浓度质粒下对应的Ct值为纵坐标，以质粒浓度的对数值为横坐标绘制标准曲线。

1.3.6 特异性及灵敏度分析

通过仪器自带熔解曲线程序分析荧光定量PCR产物的特异性。通过标准曲线确定该方法的灵敏度。

1.3.7 不同品种猪宰后45 min PFK-2/FBPase-2 mRNA转录水平的测定

取宰后45 min的太湖猪、杜洛克猪及三元杂交猪背最长肌样品提取总RNA，逆转录后采用上述荧光PCR反应体系及条件测定不同品种猪PFK-2/FBPase-2 mRNA转录水平。

2 结果与分析

2.1 cDNA第1链检测

图1 内参基因β-aaccttiinn PCR电泳图Fig.1 Electrophoretogram of the housekeeper gene β-actin

由图1可知，各cDNA都有内参基因β-actin条带扩增，表明cDNA质量较好，可用于后续实验。

2.2 重组质粒的鉴定

PCR检验阳性转化菌株，经电泳检测后可见有约216 bp和180 bp大小的目的条带（图2），与预期相符，表明目的片段已连接至pMD18-T载体上。将PFK-2/ FBPase-2与β-actin重组质粒测序结果与GenBank上的序列进行比对，其核苷酸序列完全一致（图3、4）。表明已成功构建重组质粒并保持序列的完整性。

图2 2PFK-2/FBPase-2ase-2与β--actinactin mRNA部分片段PCR扩增电泳图Fig.2 PCR amplification electrophoretogram of PFK-2/FBPase-2 and partial fragments of β-actin mRNA

图3 3PFK-2/FBPase-2ase-2基因测序结果Fig.3 Sequencing results of PFK-2/FBPase-2

图4 4β-actinactin基因测序结果Fig.4 Squencing results of β-actin

2.3 反应条件的优化及标准曲线的建立

对SYBR Green I 荧光定量RT-PCR反应条件进行优化后可知，当采用引物终浓度为0.2 μmol/L，退火时间为47 s时，反应的特异性及线性扩增范围较好。在该反应条件下建立PFK-2/FBPase-2与β-actin mRNA标准曲线。当反应体系中含1×101～1×107拷贝的猪PFK-2/FBPase-2基因片段时，扩增反应Ct值与拷贝数的对数值呈线性关系，线性方程和相关系数为：Y=-3.216X+29.716，r=0.999 7。β-actin的线性方程和相关系数为：Y=-3.231X+34.557，r=0.999 7。其中：Y为循环阈值；X为质粒模板拷贝数的对数。通过标准曲线计算得到目的基因PFK-2/FBPase-2的扩增效率为104.5%，同理根据内参基因β-actin标准曲线计算可得扩增效率为104.0%。

2.4 PFK-2/FBPase-2及β-actin基因荧光PCR特异性结果

通过熔解曲线（图5）分析表明，PFK-2/FBPase-2及β-actin基因均为特异性单峰，说明各基因荧光PCR产物为单一产物，特异性强。通过标准曲线可知，PFK-2/ FBPase-2及β-actin检测下限均为10拷贝/μL。

图5 5PFK-2PFK-2/FBPase-2ase-2（A）及A β-actinactin（B）基因熔解曲线图Fig.5 Melting curves of swine PFK-2/FBPase-2 (A) and β-actin (B)

2.5 重复性实验结果

图6 样品中PFK-2/FBPase-2（A）及β-actinactin（B）的3次重复检测结果Fig.6 Results of three replicate detections of pig PFK-2/FBPase-2 (A) and β-actin (B)

对于不同的模板浓度，3 个平行样品之间的Ct值差异不显著，说明该方法有很好的重复性（图6），图中从左到右浓度数量级依次为107～101。

2.6 不同品种猪宰后PFK-2/FBPase-2 mRNA转录水平的测定

采用建立的相对荧光定量PCR方法对太湖猪、杜洛克猪及三元杂交猪（杜洛克猪×（长白猪×大白猪））宰后45 min背最长肌PFK-2/FBPase-2 mRNA转录水平进行测定，结果见图7。由图7可知，宰后45 min时，太湖猪背最长肌PFK-2/FBPase-2 mRNA转录水平最高、杜洛克次之、三元杂交猪最低，且3 个品种间具有显著性差异（P＜0.05），因此可认为在宰后初期45 min内，肌肉能量代谢水平具有差异性。

图7 不同品种猪宰后PFK-2/FBPase-2 mRNA相对表达量Fig.7 Relative transcription levels of PFK-2/FBPase-2 mRNA of different breeds postmortem

3 讨 论

荧光定量RT-PCR具有灵敏度高、特异性强的特点，是分子生物学和医学中常用的检测手段。本研究采用SyBR Green I荧光染料法建立猪背最长肌PFK-2/ FBPase-2 mRNA RT-PCR相对荧光定量检测方法，实验结果表明，在引物终浓度为0.2 μmol/L，退火时间为47 s时，可满足特异性与高扩增效率的要求。因此在最佳反应条件下，目的基因与内参基因反应的特异性及线性扩增范围较好，所构建的标准曲线相关系数均大于0.999；灵敏度较高，可检测低于100 拷贝/μL；反应特异性强，熔解曲线只有特异性单峰，且琼脂糖电泳仅有一条特异性条带。此外，根据优化条件下标准曲线斜率计算得到的2基因的扩增效率较为一致且接近于1。由于本研究在定量方法上选择比较Ct法进行相对定量，因此在进行定量计算时，需保证目的基因与内参基因具有较一致的扩增效率，且两者扩增效率应接近于1，故本实验结果符合此要求。综上实验结果可知，本研究建立的方法可利用β-actin作内参进行相对定量，消除样品采集和RNA反转录操作过程中的误差对样品定量结果的影响，定量结果可靠[16]。

荧光定量RT-PCR方法已经在肉类研究中得到大量应用，Sieczkowska等[17]利用荧光RT-PCR方法测定3 种猪品种丙酮酸激酶（pyruvate kinase-2，PKM2）基因表达量，并研究其与糖酵解潜能和肉品质的关系，研究发现PKM2基因表达量的增加与糖酵解潜能、乳酸含量、pH值和滴水损失关系密切。此外PRKAG3作为编码AMPKγ3亚基的基因，其表达可促进糖酵解过程的进行[18]，采用荧光定量RT-PCR方法对PRKAG3与肉品质关系进行了研究，结果表明，不同品种猪骨骼肌中PRKAG3基因表达量有差异且其表达量与肌内脂肪含量呈正相关[13]。

大量研究证实，国内地方品种猪在肉品质方面较国外品种具有一定优势，PSE肉发生率较低[19-21]。因此本研究选择本地品种猪太湖，国外品种猪杜洛克及三元杂交猪的背最长肌作为样品，采用建立的方法对不同品种猪宰后45 min PFK-2/FBPase-2 mRNA转录水平进行测定，结果表明，太湖猪背最长肌PFK-2/FBPase-2 mRNA转录水平最高、杜洛克次之、三元杂交猪最低，且3 个品种间具有显著性差异（P＜0.05）。PFK-2/FBPase-2 mRNA转录水平有差异，表明3 个品种猪代谢水平具有差异性，而代谢水平与肉品质相关[22]。本研究中所选取的猪品种中，太湖猪肉品质最好，且PFK-2/FBPase-2 mRNA转录水平最高，说明肉品质与PFK-2/FBPase-2 mRNA转录水平具有一定相关性。以后可以将此方法运用于研究PFK-2/FBPase-2在正常肉与PSE肉中的转录水平，从而进一步研究PFK-2/FBPase-2与PSE肉的相关性。

4 结 论

本研究通过优化实验条件建立了相对荧光定量RTPCR技术检测猪PFK-2/FBPase-2基因转录水平的方法，结果表明所建立的方法线性关系好、灵敏度高、特异性强，目的基因与内参基因扩增效率一致，可对PFK-2/ FBPase-2 mRNA转录水平进行相对定量，对研究PFK-2/ FBPase-2与肉品质关系及其在PSE肉中的作用提供技术参考。

[1] ROSENVOLD K, ANDERSEN H J. Factors of signif i cance for pork quality: a review[J]. Meat Science, 2003, 64(3): 219-237.

[2] ABERLE E D, FORREST J C, GERRAND D E, et al. Principles of meat science[M]. 4th ed. London: Kendall/Hunt Publishing Company, 2001: 92-93.

[3] Van SCHAFTINGEN E, HUE L, HERS H G. Fructose 2,6-bisphosphate, the probable structure of the glucose- and glucagonsensitive stimulator of phosphofructokinase[J]. Biochemistry, 1980, 192(3): 897-901.

[4] ROSA J L, VENTURA F, CARRERAS J, et al. Fructose 2,6-bisphosphate and 6-phosphofructo-2-kinase during liver regeneration[J]. Biochemistry, 1990, 270: 645-649.

[5] OKAR D A, LANGE A J. Fructose-2,6-bisphosphate and control of carbohydrate metabolism in eukaryotes[J]. BioFactors, 1999, 10(1): 1-14.

[6] OKAR D A, MANZANO A, NAVARRO-SABATE A, et al. PFK-2/ FBPase-2: maker and breaker of the essential biofactor fructose-2, 6-bisphosphate[J]. Trends in Biochemical Science, 2001, 26(1): 30-35.

[7] OKAR D A, WU C, LANGE A J. Regulation of the regulatory enzyme, 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase[J]. Advances in Enzyme Regulation, 2004, 44: 123-154.

[8] 陶萍, 吴耀生. 6-磷酸果糖激酶-2/果糖双磷酸酶-2是一种重要的代谢信号酶[J]. 生命的化学, 2006, 26(2): 110-113.

[9] ATSUMI T, CHESNEy J, METZ C, et al. High expression of inducible 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase (iPFK-2; PFKFB 3) in human cancers[J]. Cancer Research, 2002, 62(20): 5881-5887.

[10] MINCHENKO O H. Overexpression of 6-phosphofructo-2-kinase/ fructose-2,6-bisphosphatase-4 in the human breast and colon malignant tumors[J]. Biochimie, 2005, 87(11): 1005-1010.

[11] CALVO M N, BARTRONS R, CASTANO E, et al. PFKFB3 gene silencing decreases glycolysis, induces cell-cycle delay and inhibits anchorage-independent growth in HeLa cells[J]. FEBS Letters, 2006, 580(13): 3308-3314.

[12] MOHAMAS N A, SHEIKHA E, FARAG A, et al. Comparison of gene nature used in real-time PCR for porcine identification and quantif i cation: a review[J]. Food Research International, 2012, 50(1): 330-338.

[13] 李梦云, 陈代文, 张克英. PRKAG3在猪组织器官中的表达差异及与胴体品质关系研究[J]. 畜牧兽医学报, 2006, 37(6): 566-570.

[14] 李龙, 尹靖东, 李凤娜, 等. 利用荧光实时定量PCR法测定猪肌肉中解偶联蛋白3 mRNA丰度[J]. 中国畜牧杂志, 2007, 43(11): 49-51.

[15] 石雅丽, 张锐, 孟志刚, 等. 一种高效提取棉花RNA的改良方法[J].生物技术进展, 2011(3): 219-222.

[16] GIULIETTI A, OVERBERGH L, VALCKX D, et al. An overview of real-time quantitative PCR: applications to quantify cytokine gene expression[J]. Methods, 2001, 25(4): 386-401.

[17] SIECZKOWSKA H, KOCWIN-PODSIADLA M, ZyBERT A, et al. The association between polymorphism of PKM2 gene and glycolytic potential and pork meat quality[J]. Meat Science, 2010, 8 4(1): 180-185.

[18] BARNES B R, MAHLAPUU M, JOHANSSON C, et al. The 5’-AMP-activated protein kinase γ3 isoform has a key role in carbohydrate and lipid metabolism in glycolytic skeletal muscle[J]. Journal of Biological Chemistry, 2004, 279(37): 38441-38447.

[19] 刘顺德. 宁夏黑猪背最长肌常规营养成分含量、组织学特性和肉质特性研究[D]. 兰州: 甘肃农业大学, 2006.

[20] 李华. 莱芜猪和鲁莱黑猪肌肉抗氧化性能及肉质特性的研究[D]. 泰安: 山东农业大学, 2009.

[21] 姚国佳. PPARδ和Myoglobin基因表达对猪肉色的影响及机制研究[D].杭州: 浙江大学, 2010.

[22] LAWRIE R A, LEDWORD D A. 肉品科学[M]. 周光宏, 李春保, 译.北京: 中国农业大学出版社, 2008: 123.

Development of RT-PCR Assay for PFK-2/FBPase-2 in Swine longissimus dorsi Muscle

LI Peng-ying, TANG Xiao-yan*, WANG Min, KANG Da-cheng, YAN Cheng-ying
(Key Laboratory of Agro-Food Safety and Quality, Ministry of Agriculture, Institute of Quality Standards and Testing Technology for Agro-Products, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China)

In order to explore the relationship between P FK-2/FBPase-2 mRNA transcription level and postmortem meat quality, a pair of primers was designed and β-actin was chosen as housekeeper gene in this study according to swine PFK-2/FBPase-2 mRNA sequences available in GenBank (NM_001143721.1). Under the optimal experimental conditions, a real-time fl uorescent quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) assay wa s established to d etect swine PFK-2/FBPase-2 gene. The results showed that both the correlation coeff i cient (R2) of the standard curves of PFK-2/FBPase-2 and the housekeeper gene β-actin were more than 0.999, the sensitivity was high and detection limits of the two genes were 10 copies/μL. In addition, the specif i city was high and the amplif i cation products were specif i cally single peaks. Meanwhile the amplif i cation eff i ciency of PFK-2/FBPase-2 (104.5%) was consistent with that of β-actin (104.0%). According to the extent of PSE meat production, the longissimus dorsi muscles of Taihu, Duroc and Duroc× (Landrace × yorkshire) were selected to measure the transcription level of PFK-2/FBPase-2 mRNA at 45 min in different breeds by the established method. The results showed that Taihu had the highest PFK-2/FBPase-2 mRNA transcript level, followed by Duroc, the lowest was Duroc × (Landrace × yorkshire), and there was signif i cant difference among these three breeds (P ＜ 0.05).

swine; PFK-2/FBPase-2 mRNA; SyBR Green I; real time-polymerase chain reaction (RT-PCR)

TS251.1

A

1002-6630（2014）14-0113-05

10.7506/spkx1002-6630-201414022

2014-03-24

国家自然科学基金青年科学基金项目（31000799）；“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAD28B03）

李朋颖（1989—），女，硕士研究生，研究方向为畜产品质量与安全。E-mail：xiaomianhu0725@126.com

*通信作者：汤晓艳（1976—），女，研究员，博士，研究方向为畜产品质量与安全标准与检测。E-mail：txycaas@126.com