响应面法优化郫县豆瓣制曲工艺

孟 甜，黄韬睿，李玉锋

（1.四川旅游学院烹饪系，四川 成都 610100；2.西华大学生物工程学院，四川 成都 610039）

响应面法优化郫县豆瓣制曲工艺

孟 甜1，黄韬睿1，李玉锋2

（1.四川旅游学院烹饪系，四川 成都 610100；2.西华大学生物工程学院，四川 成都 610039）

本实验采用Box-Behnken法分析优化郫县豆瓣制曲工艺。在单因素试验的基础上，选取曲精量、制曲温度、制曲时间为响应因素，以成曲质量指标（蛋白酶活力和α-淀粉酶活力）综合评分为响应值，建立回归模型，并结合实际操作情况，得出郫县豆瓣最佳制曲工艺条件为：曲精量0.28%、制曲温度33.50 ℃、制曲时间32.50 h，此时成曲质量指标综合评分为98.23。

Box-Behnken法；优化；郫县豆瓣；制曲工艺

郫县豆瓣是最为出名的四川调味品之一，被誉为川菜之魂[1-2]，以色泽油润红亮、酱香浓郁、味鲜辣醇和、外观黏稠绒实等特点著称[3-4]。在许多经典川菜如麻婆豆腐、回锅肉等的烹调中都必不可少，而且还是四川火锅底料中的主料，不仅增色提味，还别具风味。

传统郫县豆瓣以豆瓣为原料，霉菌为主要微生物菌种，经自然制曲、天然发酵而成[5]。制曲的目的是通过米曲霉等菌种在原料上生长繁殖，以便于在发酵时利用它们所分泌的多种酶类。这种方法通常需要7～8 d，受到季节限制不能常年生产，且成曲质量也不稳定[6]。而豆瓣质量的好坏关键在于制曲质量，因此在整个生产过程中制曲环节显得尤为重要，是豆瓣生产中最重要的质量控制点[7]。目前对豆瓣发酵工艺研究较多[8-12]，而制曲工艺的报道却较少。为了对传统的制曲工艺进行优化，在单因素试验的基础上，通过Box-Behnken法，以成曲中蛋白酶活力和α-淀粉酶活力为指标，对影响成曲质量的主要因素进行研究，并对结果加以验证。

1 材料与方法

1.1 菌种

沪酿3.042号米曲霉 中国科学院成都分院。

1.2 试剂

钼酸钠、钨酸钠、硫酸锂、磷酸、浓盐酸、碳酸钠、三氯乙酸、硼酸、氢氧化钠、磷酸氢二钠、柠檬酸、碘液 成都科龙化工试剂厂。

1.3 仪器与设备

UV-2600紫外可见分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司；ISO9001电子天平 北京赛多利斯天平有限公司；HH-S数显恒温水浴锅 江苏省金坛市医疗仪器厂；DHP-9082电热恒温培养箱 上海齐欣科学仪器有限公司；HWS-250型恒温恒湿培养箱 上海精宏实验设备有限公司；PHS-25型pH计 上海雷磁仪器厂；TMQ-R-3250自动台式灭菌锅 山东新华医疗器械股份有限公司。

1.4 方法[13]

1.4.1 蛋白酶活力测定

称取充分研细的成曲5 g，加水至100 mL，在40 ℃水浴内间断搅拌1 h，过滤，滤液用pH 7.2磷酸缓冲液稀释至一定倍数；取样品稀释液1 mL，置于40 ℃水浴中预热2 min，再加入同样预热的酪蛋白溶液1 mL，精确保温10 min，时间到后立即再加入0.4 mol/L三氯乙酸2 mL终止反应；继续置于水浴保温20 min，使残余蛋白质沉淀后过滤，取滤液1 mL，再加0.4 mol/L碳酸钠5 mL、已稀释的福林试剂1 mL摇匀，40 ℃保温发色20 min后，680 nm波长处测定吸光度。空白对照在加酪蛋白之前先加0.4 mol/L三氯乙酸2 mL，使酶失活，再加入酪蛋白[14]。

在40 ℃下，每分钟水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位，以U/g干基表示。

1.4.2 α-淀粉酶活力测定

取2%可溶性淀粉20 mL和pH 6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液5 mL于25 mm×200 mm试管中，在60 ℃恒温水浴中预热4～5 min。加入预先稀释的酶液0.5 mL，立即记录时间，充分摇匀，定时用吸管取出反应液0.5 mL，滴于预先充满比色稀碘液（约1.5 mL）的白瓷板空穴内。当穴内颜色反应由紫色逐渐变为红棕色，与标准终点色相同时，即为反应终点，并记录时间/min。1 mL酶液于60 ℃、pH 6.0条件下，1 h液化1 g可溶性淀粉，即为1个酶活力单位，以U/g干基表示。

1.5 制曲工艺

取蒸熟冷却后的蚕豆和小麦（质量比4：1）500 g，加入已与面粉拌和后的曲精（曲精、面粉质量比1：10），充分拌匀，摊平，置于恒温恒湿培养箱中按照试验设计工艺条件进行培养，中间翻曲一次。其中，曲精呈黄绿色、无夹心、无灰黑绒毛及其他异色，孢子数经测定[15]约为17×109个/g（干基计），细菌数低于104个/g。

1.6 试验设计

1.6.1 单因素试验

以蛋白酶活力和α-淀粉酶活力为指标，采用单因素试验依次对曲精量、制曲温度、制曲时间进行考察，试验水平分别选取曲精量质量分数0.05%、0.15%、0.25%、0.35%、0.45%、0.55%；制曲温度25、28、31、34、37、40 ℃；制曲时间12、18、24、30、36、42、48 h。

1.6.2 Box-Behnken试验设计

根据单因素试验结果及Box-Behnken的中心组合设计原理，采用响应面法设计三因素三水平试验方案。响应变量Y为根据蛋白酶活力和α-淀粉酶活力在成曲质量中的重要性求加权和得到的综合评分。自变量A为曲精量、B为制曲温度、C为制曲时间。本试验的设计、模型建立及数据分析，利用Design Expert 8.0.5软件辅助完成。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 曲精量考察

接种曲精量直接影响豆瓣制曲的周期。接种量大可缩短制曲周期，减少杂菌污染机会；但接种量过大，营养物质主要被用于菌体细胞增长，并产生大量代谢废物，导致微生物所处环境恶化，菌体细胞会较早衰老，且有限的营养物质也不足以维持米曲霉的生长所需，会形成大量休眠孢子，降低酶活力；接种量过小，微生物生长繁殖不足，使得营养过剩，造成浪费，增加生产成本[16]。选定制曲时间30 h、制曲温度30 ℃，考察曲精量对成曲质量的影响，结果如图1所示。

图1 曲精量对蛋白酶活力和α-淀粉酶活力的影响Fig.1 Effect of inoculum amount on protease activity and α-amylase activity

由图1可知，蛋白酶活力和α-淀粉酶活力随接种曲精量的增加而增大，达到最大值时的曲精量分别为0.25%、0.35%，相应的酶活力分别为2 135.81、133.45 U/g；随着接种量的持续增加，酶活力呈逐渐减小趋势。因此，控制接种曲精量在0.25%～0.35%。

2.1.2 制曲温度考察

温度是影响微生物生长繁殖的重要因素之一。一般来讲，温度低于25 ℃霉菌发芽缓慢；温度高于38 ℃，也不利于霉菌发芽，反而适合细菌的发育繁殖，易染杂菌，影响制曲[17-18]。在温度控制适当时，米曲霉占绝对优势，可以抑制杂菌生长，空气中的杂菌只能少量繁殖，对成曲的质量影响不大。选定接种曲精量为0.25 %，制曲时间30 h，考察制曲温度对成曲质量的影响，结果如图2所示。蛋白酶活力和α-淀粉酶活力随着制曲温度的升高而增大，达到最大值时的温度分别为34、31 ℃；随着制曲温度的继续升高，酶活力呈逐渐减小趋势。因此，控制制曲温度在31～34 ℃。

图2 制曲温度对蛋白酶活力和α-淀粉酶活力的影响Fig.2 Effect of koji-making temperature on protease activity and α-amylase activity

2.1.3 制曲时间考察

制曲时间对微生物生长繁殖有着重要影响。制曲时间过短，微生物生长没有达到最佳，原料利用率低，酶活力不高；制曲时间过长，酶活力反而逐渐下降，同时由于微生物的生长繁殖，又需要多消耗原料，增加了浪费，而且影响制曲设备的周转、增加通风机电力消耗[19]。因此以酶活力达到最高点为依据制定制曲时间。选定接种曲精量为0.25 %、制曲温度31 ℃，考察制曲时间对成曲质量的影响，结果如图3所示。

图3 制曲时间对蛋白酶活力和α-淀粉酶活力的影响Fig.3 Effect of koji-making time on protease activity and α-amylase activity

由图3可知，随着制曲时间的延长，蛋白酶活力和α-淀粉酶活力逐渐增大，二者达到峰值的时间分别为30、36 h；继续延长制曲时间，蛋白酶活力和α-淀粉酶活力逐渐减小。因此选择制曲时间在30～36 h之间。

2.2 Box-Behnken试验设计结果

Box-Behnken试验设计与结果见表1。对表1试验数据进行二次多项回归拟合，获得成曲质量指标（蛋白酶活力和α-淀粉酶活力）的综合评分Y对自变量曲精量（A）、制曲温度（B）、制曲时间（C）的多元回归方程：

该模型方差分析结果见表2。对成曲质量综合评分所建立的回归模型极显著（P＜0.000 1），且各因子系数均有意义，试验的3 个因素对蛋白酶活力的曲面效应皆显著，对综合评分的交互影响中，AB、AC交互作用显著。此外，回归模型的诊断分析表明，相关系数R2= 0.994 2，模型的信噪比为25.293，一般认为模型的可接受信噪比大于4，说明模型的拟合度和可信度非常高；变异系数越小说明试验可靠性越高，本试验的变异系数为1.73，说明试验可靠性良好。

表1 Box-Behnken设计矩阵响应数据结果Table 1 Box-Behnken design matrix with experimental results and response valluueess

表2 回归模型方差分析Table 2 Analysis of variance for the regression model

为更直观地反映响应因素对响应值的影响，对获得的回归模型进行响应面图及等高线图分析，结果如图4所示。可以看出，3 个响应因素在选定的范围内都存在响应极值，AB、AC交互作用显著，BC交互作用不显著，结果与方差分析的结果一致。由等高线和响应面图分析，结合回归模型可以预测出当曲精量（A）为0.28%、制曲温度（B）33.67 ℃、制曲时间（C）32.73 h时，成曲质量指标综合评分为98.69。

图4 各因素及其相互作用影响综合评分的响应面及等高线Fig.4 Response surface and contour plots showing the interactive effects of independent variables on comprehensive quality score

2.3 回归模型的实验验证

为验证预测值与真实值之间的拟合程度及方程的合适性、有效性，采用综合评分最大响应值对应的响应因素值进行实验验证，考虑到实际操作的方便及工艺的实际情况，对响应因素值进行修正，曲精量（A）为0.28 %、制曲温度（B）33.50 ℃、制曲时间（C）32.50 h，经过3 组平行实验，综合评分平均值为98.23，预测结果（98.69）与实验值相对偏差仅为0.47%，此时蛋白酶活力和α-淀粉酶活力平均值分别为2 071.06 U/g、138.72 U/g。证明模型是合适有效的，具有一定的实践指导意义。在后期发酵实验中[20]，测得豆瓣的氨基酸态氮含量为1.95 g/100 g，全氮利用率可达90%以上，与制曲工艺优化前相比提高了10%左右。

3 结 论

在本实验范围内，曲精量、制曲温度、制曲时间对郫县豆瓣制曲过程中米曲霉产蛋白酶活力、α-淀粉酶活力均有显著影响，显著顺序为曲精量＞制曲时间＞制曲温度，而且各因素存在一定的交互作用。

通过单因素试验和Box-Behnken试验得出郫县豆瓣最优的制曲工艺条件为：接种曲精量0.28%、制曲温度33.50 ℃、制曲时间32.50 h，在此条件下成曲质量指标综合评分可达98以上。同时，在本试验范围内建立的回归模型可靠有效，可用来预测设定条件范围内郫县豆瓣制曲工艺参数的响应值，且拟合度较好，在此条件下，豆瓣的氨基酸态氮含量为1.95 g/100 g豆瓣，全氮利用率达90%以上，与制曲工艺优化前相比提高了10%左右。研究结果可为郫县豆瓣传统制曲工艺的改进提供参数借鉴。

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Optimization of the Preparation of Pi’xian Bean Sauce Koji by Response Surface Methodology

MENG Tian1, HUANG Tao-rui1, LI Yu-feng2
(1. Department of Cuisine, Sichuan Tourism University, Chengdu 610100, China; 2. College of Bioengineering, Xihua University, Chengdu 610039, China)

Response surface methodology using Box-Behnken design was employed to optimize the preparation of Pi’xian bean sauce koji. Based on single-factor experiments, inoculum amount, koji-making temperature and time were chosen as independent variables, and the comprehensive evaluation score of koji quality indicators (protease activity and α-amylase activity) was the response variable. As a result, a mathematical model was established by Box-Behnken design. The optimal preparation conditions for Pi’xian bean sauce koji under actual operation circumstances were determined as 0.28%, 33.50 ℃ and 32.50 h for inoculum amount, koji-making temperature and time, respectively. The resulting product exhibited a comprehensive quality score of 98.23.

Box-Behnken design; optimization; Pi’xian bean sauce; koji preparation

TS264.2

A

1002-6630（2014）15-0193-05

10.7506/spkx1002-6630-201415039

2013-09-05

四川省教育厅科研基金项目（10ZC063）

孟甜（1985—），女，讲师，硕士，研究方向为食品科学。E-mail：mengtian85@sohu.com