金荞麦(-)-表儿茶素抗氧化活性研究

黄仁术，易 凡，何惠利，吴宋华亲，方娇娇，杨 敏

（1.植物细胞工程安徽省工程技术研究中心，安徽 六安 237012；2.皖西学院生物与制药工程学院，安徽 六安 237012）

金荞麦(-)-表儿茶素抗氧化活性研究

黄仁术1,2，易 凡2，何惠利2，吴宋华亲2，方娇娇2，杨 敏2

（1.植物细胞工程安徽省工程技术研究中心，安徽 六安 237012；2.皖西学院生物与制药工程学院，安徽 六安 237012）

研究金荞麦中(-)-表儿茶素活性物质的抗氧化活性。超氧阴离子自由基清除实验表明其抗氧化率达到83.08%；羟自由基清除实验表明活性物质质量浓度对清除率的影响差异极显著（P＜0.01），质量浓度为0.350 mg/mL时清除率达77.30%；还原力测定实验表明其还原力达到同质量浓度VC的48.02%，且质量浓度对还原力的影响差异极显著（P＜0.01）；乙醇提取物中活性物质含量达1.40 mg/mL，占块根干物质质量的2.52%。实验证明金荞麦(-)-表儿茶素活性物质具有很好的抗氧化活性，可作为一种天然、高效的抗氧化剂。

金荞麦；(-)-表儿茶素；抗氧化

所有需氧生物的生理过程均会产生自由基，氧自由基损伤与人类的l00 种疾病有直接关系，如动脉粥样硬化、肝病、糖尿病、癌症等[1-2]。而抗氧化剂能对抗自由基的氧化作用，有效防止正常细胞的癌变[3]。现有研究表明，植物中的多酚类、多糖、维生素类、萜类、生物碱类、苷类、谶醇类、氨基酸、蛋白质等化合物都具有抗氧化功能，能抵御自由基、延缓衰老[4]。

金荞麦（Fagopyrum cymosum (Trev.) Meism）系蓼科荞麦属多年生草本植物，属国家二级保护的野生药用植物，分布于我国黄河以南各省区[5]。金荞麦的药用部位为块根，其块根的乙醇提取物中含有原花色素的缩合性单宁混合物，主要由(-)-表儿茶素，少量的(+)-儿茶素，以及二者的二聚体和没食子酸酯构成[6]。现代药理研究表明这些类黄酮次生代谢产物具有抗肿瘤、降血糖、调节血脂、抗氧化、镇痛解热等多种功效[7]。近年来，有关荞麦属植物抗氧化活性研究的报道较多，涉及的物质包括多酚类、黄酮类、多糖、植物性膳食纤维、蛋白质等。但研究对象多为栽培品种甜荞麦和苦荞麦的芽、苗、皮、粉。如杨芙莲等[8]研究了甜荞麦壳中原花青素提取及抗氧化性；方玉梅等[9]研究了苦荞麦苗期黄酮类化合物的抗氧化性；任顺成等[10]研究了荞麦粉、皮、芽中黄酮类化合物抗氧化性；孙国娟等[11]研究了不同生长阶段荞麦芽总黄酮的抗氧化活性；钟耕等[12]研究了苦荞麦粉乙醇提取物抗氧化作用；李光等[4]研究了野生品种金荞麦叶的抗氧化活性。实质上，荞麦抗氧化活性的大小不仅与其抗氧化物质的含量有关，而且与荞麦种类和生育时期有关[2]。为此，开展金荞麦药用部位块根的乙醇提取物――(-)-表儿茶素活性物质的抗氧化活性研究，以期从野生药用植物中寻找一种天然、高效的抗氧化剂。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金荞麦块根采集自安徽省潜山县。

(-)-表儿茶素（纯度≥98%） 中国药品生物制品检定所；无水乙醇 江苏强盛功能化学股份有限公司；香荚兰素（纯度≥99.0%） 北京化学试剂公司；浓盐酸、硫酸亚铁、乙二胺四乙酸、三氯乙酸 汕头西陇化工有限公司；邻苯三酚（AR）、抗坏血酸（纯度≥99.7%） 天津市博迪化工有限公司；三羟甲基氨基甲烷 上海山浦化工有限公司；邻菲罗啉 上海凌峰化学试剂有限公司；磷酸氢二钠 上海荣润化工有限公司；过氧化氢 蚌埠骄阳药业有限公司；铁氰化钾 中国上海试剂一厂；三氯化铁 广东台山化工厂。

1.2 仪器与设备

TU-1901双光束紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；202-1型电热恒温干燥箱 上海浦东英丰科学仪器有限公司；HH-2/HH-4数显恒温水浴锅 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 金荞麦(-)-表儿茶素的提取与测定

1.3.1.1 金荞麦(-)-表儿茶素的提取

取金荞麦块根干燥粉碎物3 g，在20℃于54 mL、60%乙醇中浸泡30 min，提取物以4 000 r/min的速度离心5 min，取上清液过滤，用60%乙醇定容至54 mL，室温保存待用[13]。

1.3.1.2 金荞麦(-)-表儿茶素的测定

香荚兰素-盐酸分光光度法对表儿茶素含量测定的标准曲线：Y=0.226 2X-0.012 6，R=0.999 3，式中，Y为吸光度（A），X为测定液质量浓度/（μg/mL）；金荞麦提取液测定时，取0.1 mL提取液和10 mL乙醇于50 mL容量瓶中，用质量浓度为10 g/L的香荚兰浓盐酸定容，测定吸光度，根据吸光度和标准曲线可计算测定液中(-)-表儿茶素质量浓度[14]。

1.3.2 超氧阴离子自由基（O2-·）清除实验

O2-·清除采用邻苯三酚自氧化法测定[15]。

1.3.2.1 邻苯三酚的自氧化速率测定

自氧化组于试管中加入蒸馏水0.5 mL和pH 8.2的0.1 mol/LTris-HCl-EDTA缓冲液4.5 mL，25 ℃恒温10 min，再加入22.5 mmol/L邻苯三酚0.01 mL，迅速摇匀倒入1 cm比色皿中，在325 nm波长处测定吸光度，每隔30 s测定1次，共测8次。同时用空白对照组（蒸馏水代替邻苯三酚）调零，作吸光度随时间变化的回归方程，计算其自氧化速率△A1。

1.3.2.2 金荞麦乙醇提取物的抗氧化率测定

同上，抗氧化组以等量金荞麦乙醇提取物替代蒸馏水，做4个重复，空白对照组（蒸馏水代替邻苯三酚）调零，测定吸光度，作回归方程计算邻苯三酚自氧化速率△A2。

1.3.3 羟自由基（·OH）清除实验

·OH清除采用邻二氮菲-Fe2+氧化法测定[15]。

取1 mL 0.75 mmol/L邻二氮菲溶液于试管中，依次加入2 mL pH 7.4的0.2 mol/L磷酸缓冲溶液和2 mL蒸馏水，充分混匀后，加1 mL 0.75 mmol/L硫酸亚铁溶液混匀，37 ℃保温1 h，于536 nm处测定吸光度A0。实验重复4次。同上，以1 mL 3%双氧水替代1 mL蒸馏水作为损伤管，测定吸光度A1；以1 mL金荞麦乙醇提取物和1 mL双氧水替代2 mL蒸馏水作为实验管，测定吸光度A2。

1.3.4 还原力测定

还原力测定采用普鲁士兰法测定[15-16]。

1.3.4.1 金荞麦(-)-表儿茶素与VC还原力的比较

向1 mL磷酸缓冲液（0.2 mol/L、pH 6.6）中依次加入质量分数1%的铁氰化钾溶液1 mL、样品液1 mL，混匀，50℃反应20 min，冷却后加入质量分数10%的三氯乙酸1 mL，混匀后以3 000 r/min的速度离心10 min，取上清液2 mL与蒸馏水2 mL、质量分数0.04%的三氯化铁溶液2 mL混匀，室温下反应10 min，于700 nm波长处测定其吸光度，重复4 次。以蒸馏水组为对照组，测定质量浓度均为1 mg/mL的金荞麦(-)-表儿茶素（取1.4 mg/mL的提取液10 mL，用60%乙醇定容至14 mL）及VC的还原力。1.3.4.2 金荞麦(-)-表儿茶素还原力的测定

同上，将金荞麦(-)-表儿茶素的提取液稀释1、5、10、15倍，测定其不同稀释倍数下的还原力，探讨质量浓度对还原力的影响。

1.4 数据分析

数据方差分析采用F检验，对F检验存在差异显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）的处理，其各处理间具体的差异性检验采用新复极差法（SSR）检验。

2 结果与分析

2.1 金荞麦(-)-表儿茶素的含量测定

由表1可见，金荞麦的乙醇提取物中(-)-表儿茶素活性物质含量达到1.40 mg/mL，其块根中(-)-表儿茶素活性物质含量占到干物质质量的2.52%。

表1 金荞麦(-)-表儿茶素的含量Table 1 (-)-Epicatechin content in the root tubers of Fagopyrum dibottrryyss

2.2 金荞麦(-)-表儿茶素对O2-·的清除作用

图1 邻苯三酚自氧化回归方程Fig.1 Pyrogallol oxidation rate regressive equation

由图1可知，自氧化组回归方程为y=0.006 5x+ 1.031 1，邻苯三酚的氧化速率△A1=0.006 5，抗氧化组回归方程为y=0.001 1x+2.043 4，邻苯三酚的氧化速率△A2=0.001 1，金荞麦乙醇提取物的抗氧化率达到83.08%。

2.3 金荞麦(-)-表儿茶素对·OH的清除作用

不同质量浓度金荞麦(-)-表儿茶素的·OH清除率见表2。经F检验，F=33.61＞F0.01(5,18)=4.25，各处理间存在极显著差异（P＜0.01）；进一步用SSR法检验具体处理间的差异，发现随着金荞麦(-)-表儿茶素质量浓度的增加，对·OH的清除率影响差异极显著（P＜0.01）。当金荞麦(-)-表儿茶素质量浓度达到0.350 mg/mL时，其对·OH的清除率达到77.30%。

表2 金荞麦(-)-表儿茶素的·OH清除能力Table 2 Hydroxyl radical scavenging activity of (-)-epicatechin from the root tubers of Fagopyrum dibotrys

2.4 金荞麦(-)-表儿茶素与VC还原力的比较

1 mg/mL的金荞麦(-)-表儿茶素与1 mg/mL的VC溶液的还原力比较见表3。经F检验，F=58 701.12＞F0.01(2,9)= 8.02，各处理间差异极显著（P＜0.01）；进一步用SSR法检验具体处理间的差异，发现金荞麦(-)-表儿茶素的还原力显著低于VC（P＜0.01），其还原能力只有VC的48.02%。

表3 金荞麦(-)-表儿茶素与VC的还原力比较Table 3 Comparison of reducing power between (-)-epicatechin from the root tubers of Fagopyrum dibotrys and VC

2.5 金荞麦(-)-表儿茶素质量浓度对还原力的影响

不同质量浓度金荞麦(-)-表儿茶素的还原力比较见表4。经F检验，F=11.349 0＞F0.01(2,9)=5.95，各处理间存在极显著差异（P＜0.01）；进一步用SSR检验具体处理间的差异，发现随着金荞麦(-)-表儿茶素质量浓度的升高，其还原力逐渐增强，并且当质量浓度高于0.280 mg/mL时，其还原力显著高于0.140 mg/mL及以下低质量浓度组（P＜0.01）。

表4 不同质量浓度金荞麦(-)-表儿茶素的还原力Table 4 Reducing power of (-)-epicatechin from the root tubers of Fagopyrum dibotrys

3 结 论

黄酮类化合物包括黄酮类和黄酮醇类、二氢黄酮类和二氢黄酮醇类、异黄酮类和二氢异黄酮类、查耳酮和二氢查耳酮类、橙酮类、花色素类和黄烷醇类、双黄酮类、高异黄酮、呋喃色原酮、苯色原酮等15 种[17]。其中，黄烷醇类是一类广泛存在于天然植物中的多元酚化合物，又以儿茶素类活性物质为代表[18]。本实验测得金荞麦的乙醇提取物中(-)-表儿茶素活性物质含量达到干物质重的2.52%，即25.2 mg/g。李光等[4]研究报道金荞麦叶的总黄酮含量为89.395 9 mg/g。可见，金荞麦的黄酮类物质丰富，且以黄烷醇类中的(-)-表儿茶素为主。

金荞麦(-)-表儿茶素活性物质的抗氧化实验显示，其对O2-·有明显的清除作用，清除率达到83.08%；金荞麦(-)-表儿茶素的质量浓度极显著地影响·OH清除率，当药物质量浓度达到0.350 mg/mL时，对·OH清除率达到77.30%；1 mg/mL金荞麦(-)-表儿茶素的还原力达到同质量浓度VC的48.02%，随着金荞麦(-)-表儿茶素质量浓度的升高，其还原力极显著增强。

在荞麦属其他植物抗氧化活性研究中，何永艳等[2]报道，苦荞麦地上部分乙醇提取物的抗氧化性高于甜荞，且以盛花期最强，·OH的清除率达57.1%；而甜荞除盛花期外，在苗期和收获期几乎对·OH没有清除率。方玉梅等[9]报道，苦荞麦苗乙醇提取黄酮类化合物的质量浓度为46.674 3 μg/mL，在质量浓度为0.004 67 μg/mL时，对O2-·抑制率达到最高为84.38%，对·OH的抑制率随着黄酮质量浓度的增大而增大，46.674 μg/mL时抑制率达到最大为37.23%。黄酮类化合物的抗氧化功能是因黄酮类化合物能成为自由基的接受体，阻断自由基连锁反应；黄酮类化合物和金属生成螯合物，抑制了金属的氧化作用；黄酮类化合物还能抵抗脂肪氧化酶催化反应[19]。

综上所述，荞麦属植物乙醇提取物对O2-·的抑制率相近，且其活性物质的质量浓度对·OH的抑制率影响差异显著。金荞麦作为荞麦属的野生品种，其药用有效活性成分和效果，远远高于栽培品种[20]。鉴于(-)-表儿茶素活性物质在金荞麦中含量高，提取方法简单，又具有很好的抗氧化活性，可作为一种天然、高效的抗氧化剂加强开发，今后还需进一步研究其在动脉粥样硬化、糖尿病、癌症等病理学研究中的潜在价值。

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Antioxidant Activity of (-)-Epicatechin from the Root Tubers of Fagopyrum dibotrys

HUANG Ren-shu1,2, YI Fan2, HE Hui-li2, WU Song-hua-qin2, FANG Jiao-jiao2, YANG Min2
(1. Engineering Technology Research Center of Plant Cell Engineering, Anhui Province, Lu’an 237012, China; 2. College of Biological and Pharmaceutical Engineering, West Anhui University, Lu’an 237012, China)

The antioxidant activity of (-)-epicatechin extracted with ethanol from the root tubers of Fagopyrum dibotrys was evaluated in this study. Results showed that the (-)-epicatechin extract could scavenge 83.08% of superoxide anion radical; its hydroxyl radical scavenging capacity was very significantly affected by its concentration (P ＜ 0.01), and 77.30% of hydroxyl radical was scavenged at a concentration of 0.350 mg/mL. The epicatechi extract, showing a significant concentration-effect relationship (P ＜ 0.01), was only 48.02% as effective as vitamin C at the same concentration in reducing Fe3+. The ethanol extract contained 1.40 mg/mL active components, accounting for 2.52% of the dried root tubers of Fagopyrum dibotrys. This study proves that (-)-epicatechin from the root tubers of Fagopyrum dibotrys has strong antioxidant activity as a natural potent antioxidant.

Fagopyrum dibotrys; (-)-epicatechin; antioxidant

R931.6

A

1002-6630（2014）15-0118-04

10.7506/spkx1002-6630-201415024

2013-10-14

安徽省高校省级自然科学研究重点项目（KJ2012A280）；国家级大学生创新创业训练计划项目（201210376004）

黄仁术（1976—），女，副教授，硕士，主要从事天然活性物质开发研究。E-mail：ahhrs@126.com