肝癌细胞起源的研究现状

庞业滨，黎乐群，彭宁福(综述)，向邦德(审校)

(广西医科大学附属肿瘤医院肝胆外科，南宁530021)

根据最新的流行病学调查结果，原发性肝癌已成为全球第5位最常见的恶性肿瘤，病死率排名第3位[1]。在中国，原发性肝癌年发病率居全部肿瘤第2位，病死率仅次于肺癌居第2位[2]。原发性肝癌中绝大部分(>85%)属于肝细胞癌[3]。肝细胞癌恶性程度高，早期诊断率低，容易扩散转移，术后易复发，对于晚期肝细胞癌患者，放疗及化疗的效果十分有限，影响肝癌患者预后的主要因素仍是就诊时肿瘤的分期分级[4]。自从Bonnet等[5]首次于人类急性粒细胞白血病中分离出肿瘤干细胞样细胞群，之后在乳腺癌、前列腺癌等实体瘤中成功分离出肿瘤干细胞，研究者发现肿瘤干细胞与肿瘤的形成、发展、转移及复发、耐药有着很大的相关性。随着研究的深入，研究者开始探讨这一功能上与组织干细胞十分相似的细胞类型，本质上是否就是由组织干细胞突变而来[6]。这些研究成果使得人们不禁产生这样的疑问：对于原发性肝癌，以往的研究是否都过多关注成为“结果”的肿瘤细胞，而忽略了作为“原因”的肿瘤干细胞。

1 肿瘤的细胞起源学说

关于肿瘤的细胞起源，目前有两种主流的观点。①一种观点认为肿瘤起源于成熟的组织细胞，由成熟细胞去分化成为幼稚细胞，重新获得自我更新的能力，进而突变形成肿瘤细胞。Friedmann等[7]发现，在大鼠中由致癌基因的突变而引起神经元和星形胶质细胞的去分化会导致神经胶质瘤的形成。Lazarevich等[8]通过重排肝细胞核因子(一种维持肝细胞稳定性的因子)的基因序列，导致肝细胞的去分化、增殖并形成人与大鼠的肝细胞癌。②另一种观点则认为肿瘤起源于组织中正常的干细胞，由干细胞的分化成熟受阻，再演变成肿瘤细胞。早在2001年，Reya等[6]在总结了前人研究结果的基础上，提出“肿瘤干细胞”学说，认为肿瘤干细胞是肿瘤内可能存在的具有增殖、自我更新能力和多向分化潜能的干细胞样细胞，是肿瘤形成的起始细胞，并认为肿瘤干细胞是正常干细胞累积突变的结果，是由正常干细胞转化而来。Sell[9]认为更有理由相信肿瘤起源于正常干细胞，依据主要是：①干细胞具有自我更新和分化能力，经常处于增殖状态，因此较成熟细胞更易受到攻击而发生突变；②干细胞寿命较长，有更多机会受到多次攻击，并且有累积突变的条件，而形成肿瘤。时至今日，研究者已在众多实体瘤(如脑肿瘤、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌)中相继证实有肿瘤干细胞的存在[10]，同时不断有文献报道认为肿瘤的产生与正常干细胞突变有着密切的联系。而对于肿瘤干细胞与正常干细胞的关系，Reya等[6]认为两者有很多相似的特性：①干细胞和肿瘤干细胞均有自我更新及无限增殖能力；②干细胞和肿瘤干细胞有相同的信号转导通路，如Wnt-β联蛋白通路、Notch通路、Sonic hedgehog通路等信号通路；③干细胞和肿瘤干细胞具有端粒酶活性。但是，Marquardt等[11]认为肿瘤干细胞有自己的特性，并不完全等同于正常干细胞：①肿瘤干细胞自我更新能力的负反馈机制已被破坏，其增殖分化处于无序和失控的不平衡状态；②肿瘤干细胞缺乏正常干细胞那样的分化成熟能力；③肿瘤干细胞具有积累复制错误的倾向，而正常干细胞通过多种途径防止这种情况发生；④肿瘤干细胞有耐受遗传毒性药物及形成肿瘤的能力。根据现有的证据，肝癌起源的干细胞成熟受阻学说目前得到较多数学者的认可。

2 肝癌的干细胞起源

2.1肝干细胞 在成体肝脏组织中，肝干细胞主要有肝内源性和外源性两种来源。肝内来源主要是指位于肝内胆管最小末端的卵原细胞，是目前较为公认的肝脏干细胞。卵原细胞具有双向分化潜能，在肝实质细胞受到严重损伤，同时分裂增殖能力被阻抑的情况下，从休眠状态中活化，分化成肝实质细胞及胆管细胞，完成肝脏的结构及功能的重建。Furuyama等[12]通过对大鼠体内表达转录因子Sox9细胞的谱系追踪，证实了大鼠肝脏起始细胞定位于末梢胆管上皮。Yoon等[13]则证实在人类成体肝脏中存在着相似的肝脏起始细胞。肝外来源肝干细胞主要有血液循环中的骨髓干细胞，以及少部分胰腺上皮细胞。Liu等[14]研究发现，骨髓干细胞可在肝脏损伤或是细胞因子的趋化作用下，移行至肝脏汇管区，并在特定环境下分化成肝实质细胞及胆管上皮细胞。肝内及肝外来源的肝干细胞解剖上均定位于胆管上皮细胞和肝细胞的移行处，也即是胆管系统的末梢—Hering管及其周围。

2.2肝干细胞与肝癌发生密切相关 在肝硬化等被认为是肝癌癌前病变的慢性肝病中，通常会出现卵原细胞的增殖，提示肝脏干细胞与肝癌癌变有关。Lowes等[15]发现酒精性肝病、慢性丙型肝炎、肝硬化和肝癌等组织中均有卵原细胞出现，且随着病情程度加重而增多；在此基础上，Galicia等[16]最新的研究发现，在人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白(gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN)同源基因(注：PTEN基因和p53基因类似，是作用较为广泛的抑癌基因，在多种肿瘤中均有出现，公认简称为PTEN基因)抑癌基因缺失的动物模型中，是肝脏慢性炎症阶段促使了原始肿瘤起始细胞(tumor initial stem cell,TISC)的产生，而非PTEN基因缺失本身。最近2年，基因功能分析技术及分子病因学研究方面的进展，使得人们对于肝干细胞在肝癌发生、发展过程中的变化有了更本质的认识。在肝癌发生早期，转化生长因子β(transforming growth factor beta,TGF-β)信号途径通过中间蛋白SMAD(drosophila mothers against decapentaplegic protein)，激活细胞分化程序并抑制细胞周期循环。研究者发现，在促进分化及生长停滞的信号途径中，一些中间调节因子(如β2-Spectrin)的丢失，将会导致肝干细胞的恶性转化并形成肝癌，而在肝癌的TISC细胞群中，TGF-β促分化信号的丢失，会导致TISC内高表达胚胎干细胞转录因子Oct4和Nanog，同时赋予TISC自我更新的能力[17]。经典的β联蛋白信号途径是通过激活T细胞因子/淋巴增强因子启动子起作用，而这也是正常干细胞增殖、存活及抑制分化的机制。β联蛋白信号途径及其相关蛋白的变异则通常指β联蛋白的激活，但是Wnt途径未被启动，这一现象多在因慢性肝损伤而代偿性增殖的肝干细胞中发现，并最终导致肝癌的发生[18]。在一份最新的研究报告中，来自中国上海东方肝胆外科医院的Wu等[19]将大鼠干细胞样多能细胞——WB-F344细胞暴露于低剂量TGF-β下处理18周，发现TGF-β长期处理削弱了WB-F344细胞的干细胞潜能，却赋予了其肿瘤起始细胞的特性，包括表达TISC的标志物、自我更新能力及药物抗性的增加，以及对非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(Non-obese diabetic/severe combined immunodeficient,NOD/SCID)大鼠的致瘤性。研究最后认为，TGF-β可诱导硬化肝的干细胞样细胞恶性转化为TISC细胞，并通过依赖miR-216a/PTEN/Akt途径促进肝癌发生。归结起来，基因功能分析已确认的使肝干细胞发生转变的信号途径包括：有丝分裂原激活的蛋白激酶，磷脂酰肌醇磷酸激酶，TGF-β和β联蛋白途径，转化为TISC后高表达多能相关性转录因子，包括Nanog、Oct4、c-Myc和Sox2等[11]。由此推断，肝干细胞的自我更新失调控有可能是肝癌形成的早期事件，肝癌的发生与肝干细胞密切相关。

3 肝癌干细胞(肝癌起始细胞)的分离鉴定

迄今为止，还未能在肝癌组织中分离出真正意义上的肝癌干细胞。在分离鉴定肝癌干细胞方面，使用较多的方法是，以一些被认为是肝干细胞表面标志物的细胞表面抗原特异性标记细胞后进行分离。CD133，又称为Prominin-1，是一种跨膜糖蛋白，最初发现于神经上皮干细胞，CD133的表达已在多个人类肝癌细胞系中得到证实[20]。最近的研究表明TGF-β信号途径在机制上调控着CD133在Huh7细胞系中的表观遗传修饰，且CD133的表达水平被认为与肝癌起始有关[21]；上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)在新生肝脏组织及胆管系统中高表达，在成熟肝细胞中不表达，并且TISC信号途径β联蛋白的激活可使EpCAM的表达上调[22]，据此可以作为肝脏干细胞与肿瘤干细胞相互联系的佐证，其表达与患者预后有关[13]；CD44属于黏附分子家族，在肝癌中CD44的表达与肿瘤细胞的浸润、转移及化疗耐药有关[23]。除此之外，CD90也是报道了较多在肝癌组织中高表达的干细胞标志物[24]。由于这些标志物在肝癌细胞系中的表达率从1%～60%不等[23]，因此结合多个标志物的共表达对肝癌干细胞的筛选将更为特异。肝癌组织中高表达上述标志物的细胞较其他肿瘤细胞有更强的体外成瘤能力、更强的侵袭性、更高的耐药性和转移复发能力，并且拥有自我更新及增殖分化的能力。

此外，在肝癌组织中还分离出一种被称为侧群(side population,SP)细胞的肿瘤细胞。SP细胞由于细胞膜上存在腺苷三磷酸结合盒，能够将荧光染料Hoechst 33342转移出细胞外而被识别，这一特性也被成为SP表型。Chiba等[25]通过免疫组织化学技术发现SP细胞同时拥有肝细胞及胆管细胞表型，并且SP细胞与非SP细胞相比，表现出高增殖潜能和抗凋亡能力、高度的自我增殖和体外成瘤能力，1×103个侧群细胞即可使NOD/SCID大鼠成瘤，而非侧群细胞1×106个仍不能使NOD/SCID大鼠成瘤，据此认为SP细胞可能聚集了大部分甚至全部的肝癌干细胞。但并不是所有具有SP表型的细胞均有干细胞特性，也不是所有肿瘤干细胞都有SP表型。Lichtenauer等[26]对肾上腺皮质癌细胞系NCI-h295R的研究，以及Burkert等[27]对胃肠道癌的研究均证实，这些癌组织中的SP细胞不具有干细胞特性。Hill等[28]的研究认为，用于SP分选的Hoechst 33342染料具有细胞毒性，SP细胞由于腺苷三磷酸结合盒的转运作用而免受毒害，而非SP细胞则没有这层细胞膜上的保护性蛋白，不能存活，因此SP细胞的致瘤性可能是Hoechst 33342染料的毒性而人为导致的。

4 结语与展望

随着对肝肿瘤干细胞研究的不断深入，不断有证据支持肝癌起源于干细胞，同时也表明肝癌组织中确实存在肝癌干细胞。但是，肝癌的干细胞起源学说还面临着许多未解的难题，例如干细胞在演变为肝癌过程中经历了哪些基因变化，具体的信号转导通路如何都还未得到详细阐明。因此，对肝干细胞癌变机制的探讨，将揭示其在肝癌发生、发展和转移，以及耐药和复发过程中的作用，为研究肝癌新的诊断治疗方法提供理论依据。

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