ATP结合盒转运体在肝癌多药耐药中的研究进展

唐尚军(综述)，陈伟强(审校)

(广东医学院附属中山医院普外科，广东 中山 528415)

肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，原发性肝癌中，85%～95%为肝细胞癌尽管肝癌的诊疗技术已取得很大进展，但仍有大约80%的病例发现时已是中、晚期，且多数合并肝硬化，往往伴有肝功能异常，无法接受根治性手术治疗[1]。作为肝癌综合治疗的重要手段之一，特别是对于中晚期患者来说，化疗越来越受到重视，在临床上发挥着不可代替的作用。目前在临床上肝癌化疗效果并不明显，使用的传统化疗药物缺乏组织选择性，在体内广泛分布，在发挥疗效的同时往往产生较严重的全身性不良反应，原发性或者继发性多药耐药性(multidrug resistance，MDR)现象的产生与肝癌化疗不理想密切相关[2]。因此，研究肝癌MDR的机制，及其MDR逆转策略，对于提高肝癌化疗效果具有十分重要意义。

1 MDR

肿瘤细胞的MDR是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生耐药性的同时，对其他多种结构和作用靶位不同的抗肿瘤药物也有耐药性[3]。肿瘤细胞MDR产生的原因和形成机制十分复杂和多样，成为广大学者研究的焦点，主要涉及药物靶点的改变、药物的失活/脱毒、药物摄取的减少、药物外排增加、细胞凋亡途径的调节异常等机制[4]。在上述众多机制中，ATP结合盒(ATP-binding cassette，ABC)转运体介导的细胞毒性药物的外排是确立最早、研究最充分的经典MDR途径，此类转运体能将已进入细胞内的外源性物质从胞内泵出胞外，被认为是众多肿瘤细胞MDR的主要原因[3,5]。

2 ABC转运体及其介导的多药耐药的机制

ABC转运体家族是一大类跨膜蛋白，广泛存在于所有的生物中[6]。因其特有的ABC结构域而得名，通常由全转运子或半转运子组成。全转运子含有2个跨膜区和2个核苷酸结合区，而半转运子只含1个跨膜区和1个核苷酸结合区。ABC转运体利用ATP水解产生的能量将与其结合的底物(包括抗癌药物)外排，从而使药物在肿瘤细胞的浓度大大降低从而产生耐药性。到目前为止，人类编码ABC转运体的基因组含有49个家族[7]。已被证实至少有15个转运体具有药物外排功能[8]。细胞膜上影响MDR且研究较深入的ABC转运体主要包括有P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)、多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated protein，MRP)和乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein，BCG2)。

3 ABC转运体在肝癌细胞中的表达情况

某些特定的ABC转运体在肝癌细胞、组织中呈高表达状态。Huesker等[9]证实，肝癌耐药与MDR1的过量表达有重要的关系,是肝癌化疗耐药的主要原因。王百林等[10]发现，在术前未化疗的原发性肝癌组织、肝癌癌旁组织及肝硬化中均有不同程度的MRP基因表达，而原发性肝癌组织MRP基因表达较其他两种组织显著增高，表明肝癌的MDR与MRP有关。多项研究证实，MRP1、MRP2、MRP3、MRP6、MRP7在肝脏中都不同程度高表达[11-12]。BCG2在胎盘、肝脏、血脑屏障等分布广泛，也是参与多药耐药的主要成员之一[13]。Sukowati等[14]证实，BCG2的基因表达与肝细胞癌不同分化阶段具有相关性，在阿霉素诱导下，BCG2快速上调，强调其在肝脏肿瘤的MDR中同样起着重要作用。

随着肿瘤干细胞理论发展，研究证实肝癌中存在肝癌干细胞的表达，进一步指出肝癌干细胞能表达多种ABC转运体，包括MDR1、MRP1、MRP3和BCG2等[15]。Zhu等[16]证实，CD133+、CD44+的肝癌细胞可能代表了肝癌干细胞亚群，该亚群肝癌细胞的MDR1、MRP1及BCG2表达水平高于其他亚群肿瘤细胞。ABC转运体在肝癌细胞、肝脏祖细胞或者肝癌干细胞均不同程度高表达，这些ABC转运体表达增加或者功能增强均可导致药物外排，导致化疗抵抗。因此，克服在肝癌中由ABC转运体介导的多药耐药为进一步提高化疗疗效显得格外重要。

4 传统ABC转运体抑制剂

直接抑制ABC转运体介导的药物外排作用是逆转其引起MDR的最简便和直接的途径。到目前为止，已研发出三代数十种化学药物逆转剂。但是，即使针对ABC转运体的功能和过表达的逆转剂已取得一定的研究进展，多局限于体外肝癌细胞系和动物模型等基础性研究，鲜有成功应用于临床的报道，主要原因如下：不可接受的细胞毒性效应；改变了合用传统抗癌药物的药动学；缺乏合适的针对性患者；活体内的多种因素可影响药物的分布、代谢、清除、生物药效率等[17]。因此，寻找高效、低毒的且不影响合用化疗药物的药动学，不影响肝脏解毒的第4代逆转剂，或者研发新的逆转策略成为今后肿瘤药理学研究的重要领域。

5 肝癌中MDR逆转新策略

由于传统逆转剂的局限性，一些新的逆转策略被提上议程并取得了不同程度的进展，如酪氨酸激酶抑制剂应用；沉默耐药蛋白表达；通过纳米技术脂质载体运送抗癌药，改变药物进出细胞的途径以及运用单克隆抗体、反义寡核苷酸、核酶和干扰小RNA(small interfering RNA，siRNA)等技术；免疫治疗以及中草药的应用等[18]。这些新的逆转策略为克服肝癌多药耐药，提高肝癌患者的生活质量带来了一片曙光。

5.1酪氨酸激酶抑制剂 分子靶向酪氨酸激酶抑制剂是肿瘤治疗研究的一个新领域，由于这类药物作用的高选择性以及较小的不良反应，成为近年来抗癌药物研究的热点和发展趋势。近年来，以索拉非尼为代表的靶向治疗给中晚期肝癌患者带来了新希望[19]。通过体外生物化学及细胞评价方法，发现部分酪氨酸激酶抑制剂可以抑制ABC转运体的功能，或者影响其蛋白或信使RNA的表达，从而提高传统化疗药物的作用[20]。Xiang等[21]证实，BIBF 11120在体外对肝癌耐药细胞株HepG2/ADR有明显的逆转作用。Wei等[22]证实，索拉非尼在4 μmol/L时可以部分逆转肝癌细胞中MDR，其机制可能与下调MDR1基因表达或MDR1表达有关,同时增加阿霉素、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、顺铂等化疗药物在细胞中的累积。以上研究表明，部分酪氨酸激酶抑制剂能够调节MDR表型的肝癌细胞的多药耐药，为实现高度耐药表型的患者提供个性化治疗提供可能。

5.2ABC转运体的基因多态性 众多报道表明，个体的遗传差异性在药物的治疗功效和不良反应的产生中扮演重要的角色[23]。ABC转运体基因多态性及其表达和功能的差异，可导致不同群体或个体对某些疾病存在不同的易患性，是影响药物耐药及药物个体间差异的重要因素之一，将为临床合理用药提供理论和实践依据[24]。因此，检测肿瘤组织中的ABC转运体家族对于指导临床合理选用化疗药物、评价化疗效果具有重要意义，ABC转运体家族有可能成为治疗肿瘤临床耐药的分子靶标。

5.3基因治疗 微RNA(microRNA，miRNA)是长度为18～25个碱基的非编码小RNA，主要在基因转录后水平抑制基因翻译，或对信使RNA进行降解，影响基因表达。目前的研究表明，miRNA具有调节多种细胞进程包括凋亡、分化、细胞增殖和细胞耐药性的功能[25]，miRNA在肿瘤耐药性方面的作用也逐渐引起重视。在肝癌细胞和临床肝癌患者中，miR-21能够调节肿瘤坏死因子α和5-氟尿嘧啶的抗肿瘤效果[26]。在转染了miR-21的反义寡核苷酸后，肝癌细胞增加了对肿瘤坏死因子α/5-氟尿嘧啶联合剂的敏感性，进一步说明miR-21在肝细胞癌耐药性方面起着重要的调控作用。随着越来越多参与肿瘤耐药的miRNA的发现，以及对肿瘤耐药机制的了解，尤其是miRNA介导耐药概念的提出，使得对耐药性肿瘤个体化治疗重新带来了曙光。

近几年,siRNA介导的基因干扰技术又为多药耐药基因治疗研究提供了一个全新的技术平。RNA干扰是一种广泛存在，由外源或内源性的双链RNA诱发的同源信使RNA特异性沉默，进而抑制其相应基因表达的过程[27]。Pan等[28]成功构建靶向MDR1的表达载体-短发夹RNA/mdr1表达载体(pSUPER-shRNA/mdr1)分别从细胞及动物层面进行实验，结果表明，无论是细胞层面还是动物层面(皮下移植瘤)，伴随着MDR1表达的显著抑制，人肝癌细胞株HepG2细胞对阿霉素的治疗抗性都有不同程度地降低，MDR作用得以逆转。Yoo等[29]研究显示，星形胶质细胞增高基因1(astrocyte elevated gene-1，AEG-1)在超过90%的肝细胞癌样本中过表达，而在正常人肝细胞中几乎不表达。MDR1作为AEG-1的下游产物，增加AEG-1表达可增加MDR1基因的表达，相反，靶向AEG-1的siRNA可同时抑制AEG-1及MDR1的表达。RNA干扰沉默机制的高效性、特异性及稳定性使这一技术成为生物医学领域研究的一次划时代的革命。siRNA技术在沉默癌基因、抑制抗凋亡癌基因、减少过度表达的生长因子和受体、抗血管生成、抑制肝癌细胞化疗耐药、降低肝癌细胞的侵袭转移能力等方面均取得了可喜的研究成果，部分研究已从体外试验过渡到体内试验，为肝癌的临床治疗奠定了基础。但在这一技术广泛应用于临床前，仍存在一些问题，需要进一步的研究。

5.4纳米载体技术 在肿瘤化疗中，纳米载体正在迅速发展成为一个有效的药物输送载体。同时增加药物的选择性和克服药物的MDR的方法，就是包含治疗药物和增敏剂通过相同的纳米载体同时传递到肿瘤细胞[30]。多功能的纳米载体通过不同的机制包括传递特异性靶向药物、外排泵抑制剂，调节凋亡阈值和调节肿瘤细胞内的pH值等，具备克服MDR抗肿瘤的潜能[31]。Li等[32]介绍了不同纳米粒子的联合方案羟磷灰石纳米粒子与重组突变人肿瘤坏死因子α系统应用于克服肝癌化疗的MDR。同时,重组突变人肿瘤坏死因子α能够显著减少肝细胞癌中BCRP、MDR1的基因和蛋白水平,被认为是非常重要的一种新型MDR逆转剂。随着研究的深入，各种新的不同原理的药物传递载体系统应用于克服肿瘤的耐药性[33]。

5.5中药逆转 中药具有来源广泛、价格低廉、毒性反应小等优点，有望为逆转肝癌MDR开辟出一条新的道路。李起等[34]发现，肝癌-1号可通过抑制人肝癌耐药细胞株HepG2/ADR中MDR1信使RNA的表达及MDR1的合成而部分逆转其耐药性。目前，研究报道的肝癌多药耐药中药复方逆转剂品种相对较少，在阐明其药效及作用机制的基础上，开发更多具有MDR逆转作用的中药复方应用于肝癌临床治疗，还有待于进一步的研究。

5.6其他策略 随着研究的深入，已被证实某些信号通路还能直接参与ABC转运体的调控，影响其蛋白的表达，成为逆转MDR新的研究热点。目前已证实，参与MDR1介导肿瘤细胞MDR的信号通路包括促分裂原活化蛋白激酶、c-Jun氨基端激酶、p38、丝氨酸/苏氨酸激酶和蛋白激酶C信号通路等[35]。全面的研究探讨这些信号通路有助于进一步了解肝癌发生耐药的机制，为其治疗靶点提供新的科学依据，更好地指导临床工作。

此外，基于正常干细胞具备天然抗药性特点的推测，肿瘤对于化疗药物的耐药性可能也与肿瘤干细胞的耐药特性相关。肿瘤干细胞除了具备自我更新及分化潜能，还保留着其他区别于成熟分化细胞的特质，肿瘤干细胞大部分时间处于静止状态、表达多种ABC转运体，从而抵抗药物和毒物的损害；同时具有DNA 修复能力和抗凋亡能力[36]。在干细胞的这些特质中，被广泛关注的是它们高水平表达某些特异性ABC转运体。因此，肿瘤干细胞的治疗可能成为今后克服肿瘤化疗耐药的突破口，研究肿瘤干细胞的耐药机制将有助于肿瘤化疗的进展。

6 小 结

肝癌是全球常见的恶性肿瘤，在我国尤其高发，化疗未见对改善生存质量有明显裨益，MDR降低了化疗药物在肝癌治疗中的效果。尽管一些药物通过干扰某些特定的ABC药物转运体的功能，或者影响其量的表达，从而克服MDR以提高疗效，但由于其自身毒性，改变合用传统抗癌药物的药动学等限制了在临床中的应用。本文强调了ABC转运体在肝癌MDR机制中的重要地位，但它却不是产生MDR的唯一决定因素，肝癌MDR的产生是各种因素共同作用的结果，机理十分复杂。新的耐药机制及其克服耐药措施不断被提出，但是绝大多数仍处于实验研究阶段，一些关键问题仍然没有研究清楚。克服肝癌MDR，提高化疗效果仍是一项长期的艰巨的系统工程。

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