兰州百合高效再生体系的建立

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（1酒泉职业技术学院生物工程系，甘肃酒泉 735000；2甘肃省农业科学院林果花卉研究所，甘肃兰州733000）

兰州百合高效再生体系的建立

崔兴林1秦新惠1*刘 芬2伊万伟1

（1酒泉职业技术学院生物工程系，甘肃酒泉 735000；2甘肃省农业科学院林果花卉研究所，甘肃兰州733000）

以兰州百合新鲜鳞片为试材进行高效再生体系的研究。结果表明：兰州百合中层、内层鳞片比外层鳞片容易再生不定芽，更适于作为外植体。鳞片在MS+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA的诱导培养基上再生频率最高，可达90%；不定芽在MS+0.8 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA的增殖培养基上增殖率最高，平均每芽新增芽4.5个；不定芽在MS+0.8 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1AC的壮苗生根培养基上鳞茎的膨大倍数最高，生根数量较多，小苗长势优，移栽后成活率达98%以上。

兰州百合；NAA；6-BA；再生体系

兰州百合〔Lilium．davidii Duch. var. unicolor（Hoog）Cotton〕为百合科百合属，其鳞茎硕大、洁白如玉、包合紧密、鳞片肥厚、粗纤维少、嚼之无渣，具有很高的食用价值，在西北地区产量高、品质佳，已成为全国知名品牌。兰州地区约有150年的百合栽植历史，主要分布在兰州市南郊的二阴山区。目前，由于长期无性繁殖导致病毒病日趋严重，兰州百合种性退化，生长周期长，品质和产量下降，亟须进行品种改良。建立稳定的高效离体再生体系是实现兰州百合品种改良的基础和前提（韩华丽和郭成金，2009；刘静，2011），本试验利用兰州百合鳞片诱导分化不定芽，进行继代培养，探讨生长调节物质及活性炭对兰州百合鳞片再生、不定芽增殖及鳞茎膨大生根的影响，以期建立兰州百合高效离体再生体系。

1 材料与方法

试验于2012年6月至2013年11月在酒泉市高科技农业示范园开展。

1.1 材料

试验材料为外形饱满、颜色洁白、健壮无病虫害的3 a生兰州百合鳞茎。剥去外层有创伤或带有褐色小点的鳞片，剥取鳞片的外两层、内两层、中层，冲洗干净，做好标记，用滤纸吸干水分后分别在3～5 ℃低温条件下预处理5～7 d，再用70%酒精浸润灭菌30 s，0.2%升汞溶液灭菌8 min，无菌水冲洗后用滤纸吸干水分，切成5 mm×5 mm的小块，作为诱导培养的外植体。

1.2 方法

1.2.1 细胞分裂素与生长素对鳞片再生的影响 以MS为基础培养基，加入30 g·L-1蔗糖、7 g·L-1琼脂，添加不同比例的细胞分裂素（6-BA）和生长素（NAA），诱导鳞片再生不定芽。6-BA的浓度分别为0.5、1.0 mg·L-1，NAA的浓度分别为0.1、0.5、1.0 mg·L-1，配置成6种不同的诱导培养基；以MS0（不添加6-BA和NAA）为对照。每处理10瓶，灭菌后每瓶接种5 mm×5 mm的内层、中层、外层鳞片各1块，先进行1 d 的黑暗培养，然后进行光照培养，光照周期为L∶D=16 h∶8 h，光照强度为2 000～3 000 lx，培养温度为（25±2）℃。观察统计内层、中层、外层鳞片诱导不定芽的情况。鳞片接种后45 d，统计再生芽数和不定芽再生频率。

1.2.2 细胞分裂素与生长素对不定芽增殖的影响以MS为基础培养基，加入30 g·L-1蔗糖、7 g·L-1琼脂，另分别添加0.5、0.8 mg·L-1的6-BA，再分别加入0.05、0.10、0.50 mg·L-1的NAA，配置成6种不同的增殖培养基。不定芽形成并长出1～2片叶时，转接到上述培养基上进行不定芽继代培养，以生产上常用的增殖培养基MS+0.10 mg·L-16-BA+0.01 mg·L-1NAA为对照。每处理10瓶，灭菌后每瓶转接5个不定芽，观察小苗的长势。30 d后统计新增芽数。

1.2.3 不同浓度活性炭（AC）对鳞茎生长及生根的影响 将增殖生长30 d后的小苗剪去叶片，不定芽单个分开，接种到不同浓度AC的壮苗生根培养基MS+0.8 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖上，AC浓度分别为0、0.3、0.5、1.0、3.0、5.0 g·L-1。每处理5瓶，5次重复，35 d统计鳞茎生长及生根情况（王和飞和林应耀，2005）。

2 结果与分析

2.1 外植体再生不定芽的形态学观察

兰州百合外植体接种在培养基上，7 d左右边缘翘起，变绿；14 d后切口处有褐化现象，近轴面基部伤口处分化出分生组织，形成愈伤组织，鳞片内层形成肉眼可见的1～2 mm小突起，随着培养时间延长，小突起逐渐变大、颜色逐渐加深；21 d 后小突起逐渐发育成膨大的不定芽（图1-a）。继续培养14 d，不定芽膨大并开始展叶（图1-b）。

无论是何种激素配比处理，中层、内层鳞片再生频率均高于外层鳞片，更适于作为外植体。

图1 兰州百合外植体

2.2 细胞分裂素与生长素对兰州百合鳞片再生的影响

兰州百合鳞片在6-BA和NAA不同浓度配比的6种培养基上均能诱导出不定芽，但诱导效应不同（表1）。6-BA浓度为0.5 mg·L-1、NAA浓度为0.5 mg·L-1的培养基诱导率最高，为90.0%，且小苗的长势最好；6-BA浓度为1.0 mg·L-1时，随NAA浓度的增加，诱导率虽较高，但分化出的丛芽太过密集，单芽质量差，有的还出现畸形、玻璃化等现象，说明NAA浓度过高或过低均不利于不定芽的诱导，且小苗长势一般。

表1 不同激素浓度配比对兰州百合鳞片再生的影响

2.3 细胞分裂素与生长素对兰州百合不定芽增殖的影响

将经诱导分化的不定芽接种在含6-BA和NAA不同浓度配比的6种增殖培养基上，15 d后长出新芽。由表2可知，T4处理不定芽增殖率最高，且小苗长势最好。6-BA浓度不变时，随着NAA浓度增加，平均每芽新增芽数也减少；NAA浓度不变时，随着6-BA浓度增加，新增鳞芽数增加，表明较高浓度的细胞分裂素及较低浓度的生长素有利于兰州百合不定芽增殖。

2.4 不同浓度AC对兰州百合鳞茎膨大生根的影响

将增殖的健壮不定芽接种在不同AC浓度的培养基上，35 d后均生根（表3），且鳞茎平均鲜质量、平均直径均随AC浓度的增加呈先增加后降低的趋势，生长势表现为先强后弱，而平均生根数逐渐下降，但均明显高于不含AC的处理，说明加入适当浓度的活性炭有利于鳞茎的膨大和生根。

表2 不同激素浓度配比对兰州百合不定芽增殖的影响

表3 不同浓度AC对兰州百合鳞茎膨大生根的影响

3 结论与讨论

本试验分别以兰州百合的内层、中层、外层鳞片为外植体进行诱导培养，发现中层鳞片再生的鳞茎最多且较大，内层鳞片次之，外层鳞片最差，且外层鳞片机械损伤严重，病菌多，易于污染。

本试验结果表明，外植体在6-BA浓度为0.5 mg·L-1、NAA浓度为0.5 mg·L-1的培养基上诱导培养45 d后不定芽再生率最高，为90%，且不定芽形成的小苗长势最好，这与李倩中等（2003）得出的6-BA、NAA浓度组合相一致；最适不定芽增殖培养基为MS+0.8 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA，培养30 d后每个不定芽可增殖4.5个，小苗长势壮，这与王刚等（2002）报道的结果相一致；将增殖的不定芽接入MS+0.8 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1AC壮苗生根培养基中，35 d后鳞茎略膨大、长有2～3片叶、生出4～5条根时移栽，营养土配方为珍珠岩∶草炭土=2 V∶8 V，成活率可达98%以上。

本试验是在基本恒定的环境条件下开展的，环境因子与影响鳞片分化、鳞芽增殖、鳞茎膨大的激素浓度和配比的相关性，培养系统中最佳的环境与激素组合等问题还需要深入研究。

韩华丽，郭成金．2009．兰州百合的组织培养．天津师范大学学报：自然科学版，29（3）：62-65．

刘静. 2011. 兰州百合快速繁殖研究. 南方农业学报，42（8）：839-842．

李倩中，刘晓青，陈尚平．2003．不同浓度IBA和6-BA对百合组织培养的影响．南京农专学报，19（2）：43-45．

王刚，杜捷，李桂英，梁万福，幸亨泰． 2002．兰州百合和野百合组织培养及快速繁殖研究．西北师范大学学报：自然科学版，38（1）：69-71．

王和飞，林应耀．2005．百合组织培养生根的初探．琼州大学学报，12（2）：24-26．

Establishment of Highly Efficient Regeneration System of Lanzhou Lily

CUI Xing-lin1，QIN Xin-hui1*，LIU Fen2，YI Wan-wei1

（1Biological Engineering Department，Jiuquan Vocational and Technical College，Jiuquan 735000，Gansu，China；2Institute of Woods and Flowers，Gansu Province Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 733000，Gansu，China）

Taking fresh Lanzhou lily〔Lilium. davidii Duch. var. unicolor（Hoog）Cotton〕scale as explant，this paper explored the establishment of highly efficient regeneration system．The results showed that the middle and inner layer of the scales were superior than the outer ones，and more suitable to be explant．The scales regeneration frequency reached the highest in medium of MS+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA，up to 90.0%．A small bud had the highest proliferation rate in the medium of MS+0.8 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA，with an average number of 4.5 per bud new shoots．The medium of MS+0.8 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1AC facilitated the enlargement growth of test-tube plantlets，and their survival rate was over 98% after transplanting．

Lanzhou lily；NAA；6-BA；Regeneration system

崔兴林，男，讲师，主要从事园艺教学及科研工作，E-mail：jqzycxl@126.com

*通讯作者（Corresponding author）：秦新惠，女，副教授，主要从事植物组织培养、无土栽培的教学与研究工作，E-mail：qinxinhui@126.com

2013-12-12；接受日期：2014-01-07

2012酒泉市市列科技计划项目