制药废水的生物降解研究

聂小倩 王艳艳 熊开和 黄应平 方艳芬

（三峡大学三峡地区地质灾害与生态环境湖北省协同创新中心，湖北宜昌 443002）

制药废水具有排放量大、污染物种类繁多、有毒有机物含量高等特点.随着水污染处理技术的发展，出现了许多新的处理技术，其中由于生物降解处理工业废水中的有毒污染物效果明显，现已成为降解有毒有机污染物主要方法之一［1］.筛选出对工业废水中各类不同的有毒有机污染物均有较强降解能力的微生物，可以提高生物处理法对废水中有毒类有机污染物的处理效果.利用微生物降解的方法处理含高浓度有机污染物的工业废水具有处理成本低、经济效益好、无二次污染等优点.因此研究高效降解微生物处理工业废水具有重要的意义［2－5］.

本文研究对象为宜昌某制药厂排放的制药废水以其废水为碳、氮源，通过选择性富集，驯化培养，划线分离纯化和筛选等方法，分别从三峡大学求索溪、三峡大学教师公寓旁池塘、三峡大学校医院旁的池塘的活性污泥中分离得到降解能力最强的菌株.然后，进一步利用单因素优化法得到该菌株降解制药废水的最适条件.

1 实验材料及方法

1.1 菌种及制药废水来源

原始的菌种来自①三峡大学校医院旁池塘的污泥；②三峡大学求索溪的污泥；③三峡大学教师公寓附近池塘的污泥.

制药废水：该废水为农药制品所需原料（甘氨酸）车间排放的废水，该废水主要含有氯化铵和甘氨酸等初始原料，无色澄清透明、有刺鼻的氨水味道、废水显碱性，pH为9.0，COD为8 580mg／L，BOD5为2 360 mg／L，其两者比值约为0.3，表明用微生物氧化处理要较好.取样回来后，将废水和污泥曝气静置24h，制药废水使用前用0.45μm滤膜过滤除菌.

1.2 实验试剂

牛肉膏（BR）；蛋白胨（BR）；葡萄糖（AR）；KH2PO4（AR）；K2HPO4（AR）；无水CaCl2（AR）；MnSO4·H2O（AR）；NH4NO3（AR）；H2SO4（AR）.

1.3 实验仪器

SW－CJ－2G型（名牌之星）双人净化工作台（苏州净化设备有限公司），电子分析天平（梅特勒－托利多仪器上海有限公司），高压灭菌锅，COD回流装置，XTL光学显微镜（上海昌安电子科技有限公司），pHa－P数字式酸度计（梅特勒－托利多仪器上海有限公司），金怡智能生化培养箱（上海新菌医疗机械制造有限公司），PR－ZDYC－1水浴恒温振荡摇床（上海普瑞斯仪器有限公司），TG16－W型高速微量离心机（长沙平凡仪器仪表有限公司）.

1.4 实验方法

1.4.1 微生物降解制药废水能力的测定

COD值反映了水体受还原性物质污染的程度［6］.本实验采用重铬酸钾法测定COD值［7］.

本实验采用跟踪COD值的方法来测定菌株培养过程中制药废水的COD，通过计算制药废水COD的降解率（%）来表示菌株对制药废水的降解能力.

式中，COD0为实验前制药废水的COD值；CODn为实验一定时间后制药废水的COD值.

1.4.2 菌株的富集

配制富集培养基［8］并调节pH至7.0，用纱布包扎好后置于高压灭菌锅中灭菌30min.待培养基冷却后，将其分装于250mL的锥形瓶中.每个锥形瓶中加入35mL富集培养基，再加入曝气静置24h的制药废水10mL，最后分别加入3处污泥各5mL（共计50 mL），置于摇床中，30℃恒温振荡培养3d.

1.4.3 菌株的驯化

菌株的驯化分为3组：A制药废水和三峡大学求索溪污泥；B制药废水和三峡大学校医院旁池塘污泥；C制药废水和三峡大学教师公寓旁池塘污泥；每组做3个平行样.第1次驯化，在9个250mL的锥形瓶中分别分装35mL已灭菌的无机盐培养基［8］，加入5mL富集培养基.在无菌条件下将10mL制药废水分别加入到9个250mL的锥形瓶中，培养液组后总体积均为50mL.第2、3次驯化的无机盐培养基体积分别为25mL和15mL，制药废水体积分别为20mL和30mL，总体积保持为50mL.以3d为一个周期，共进行3个周期的驯化，每个周期开始前及结束后，均测定每瓶培养液的COD值，再计算其降解率.每个周期后选对制药废水降解率最高的培养液作为下一次的驯化的接种源.

1.4.4 菌株的分离与纯化

经过了3个周期的驯化后，取制药废水降解率最高的培养液在含有制药废水的无机盐平板上涂布（废水与无机盐培养液体积比为3∶2），倒置于恒温培养箱30℃恒温培养.挑取单菌落于上述无机盐平板上反复划线分离，最终得到纯的单菌落.将得到的纯菌落用灭菌过的接种环接种于含有制药废水的牛肉膏蛋白胨［9］斜面上，4℃冰箱贮藏.

1.4.5 菌株的初步鉴定

观察无机盐平板上单菌落的菌落培养特征并记录在册.于无菌条件下，用接种环少量挑取单菌落涂玻片，进行美蓝染色及革兰氏染色［10］.于显微镜下观察染色结果，初步鉴定菌株的形态及结构特征.

1.4.6 菌株降解废水的最适条件研究

取出贮藏的菌落，挑取菌落制成菌株悬液，在无菌的条件下将菌株悬液接种到混有制药废水的无机盐培养液中，保持培养液总体积为50mL.采用单因素优化法，即每次实验确定一个因子为变量（底物体积分数，温度和pH），其他的因子保持不变，在摇床中恒温振荡培养3d后，测定COD值，计算其对制药废水的降解率，确定出最适的降解条件［11－12］.

1.4.7 制药废水在最适降解条件下的降解曲线

在最适条件下，以总体积的20%的接种量接入到已灭菌的无机盐培养基中，置于摇床中恒温振荡培养.每隔10h取一次培养液，测定其中的残留COD，依据前后COD的变化来计算其降解率，绘制最适条件下的制药废水降解曲线［13］.

2 结果与讨论

2.1 驯化结果

2.1.1 第1次驯化

取含有微生物的富集培养基5mL加入到含有10mL制药废水的培养液中（培养液总体积为50 mL），调节培养液pH为7.0，置于摇床中30℃恒温振荡培养3d.测定培养前后培养液的COD值，计算微生物对废水的降解率.3个样点污泥中的微生物的第1次驯化结果见表1.

表1 第1次驯化结果

从表1中可以得出，3个取样地点微生物对制药废水降解能力的强弱顺序为：求索溪＞校医院＞教师公寓.求索溪污泥中的微生物对废水的降解能力最好，平均降解率可达到39.3%.因此，选取降解率最高的A2培养液作为第2次驯化的接种源.

2.1.2 第2次驯化

取5mL第1次驯化中的A2培养液进行第2次驯化，结果见表2.

表2 第2次驯化结果

通过表2可以看出，经过第2次驯化后，微生物对废水的平均降解率可达到65.5%.比较第1次驯化和第2次驯化结果可得出：经过了两次驯化后，求索溪底泥中的微生物对制药废水的降解率提高效果明显，且增幅较大.

2.1.3 第3次驯化

取第2次驯化中降解率最高的制药废水的A2培养液进行第3次驯化，结果见表3.

表3 第3次驯化结果

通过表3可以看出，第3次驯化后的，求索溪污泥中的微生物对制药废水的平均降解率可达到78.0%，同前两次相比依旧有较大幅度的提高.对第3次降解率最好的A2培养液进行一系列的划线分离，筛选单一纯种的菌株，以研究这个菌株对制药废水降解最好的效果下的最佳降解条件（最佳温度、pH和底物体积分数）.

2.2 菌株的筛选

在整个驯化培养过程中，可以明显的观察到无机盐培养液由原先澄清透明的状态逐渐变得浑浊不清，而且溶液变为浅棕色，有块状物悬浮在溶液表面，表明培养液中有微生物在生长.污泥经过含有制药废水的富集培养基进行富集培养、含有制药废水的无机盐培养基进行驯化、多次划线分离和纯化，最后在牛肉膏蛋白胨培养基（废水与牛肉膏蛋白胨培养液体积比为3∶2）上分离得到对制药废水具有极强降解能力的优良菌株QA.

2.3 菌株的初步鉴定

2.3.1 菌落形态特征

菌落形态符合细菌菌落的典型特征，其菌落湿润、光滑、半透明、粘稠、易挑取、质地均匀，以及菌落正反面或边缘中心的颜色与中央部位的颜色一致，呈乳白色.其菌落大小为0.96cm.

2.3.2 菌体形态特征

菌体呈球状，单个、成双或多个聚集排列.

2.3.3 染色特征

其革兰氏染色结果为革兰氏阴性.

2.4 菌株降解废水的最优条件研究

2.4.1 温度对降解的影响

在无菌条件下，取5mL QA菌悬液接种到含有30mL制药废水的无机盐培养液中（培养液总体积为50mL），调节pH为7.0.置于不同的温度梯度（20、25、28、30、32、35和40℃）条件下恒温振荡培养3d，每个温度条件下做3个平行样品.分别测定实验前后培养液的COD，根据实验前后的COD值得出QA菌株在不同温度条件下对制药废水的降解率.实验结果如图1所示.

图1 温度对菌株降解废水的影响

由图1可知，20℃时QA菌株对制药废水的降解率为36.7%，随着温度的逐渐升高，降解率也在逐步升高.当温度达到30℃时，降解率达到78.3%.当温度继续升高超过30℃时，废水降解率逐渐下降，至40℃时，降解率下降到最低值26.9%.因此30℃是QA菌株降解制药废水的最佳降解温度条件.这是因为微生物降解废水涉及到生物体内的一系列生物化学反应，而这些生物化学反应的进行是离不开生物酶的作用的.由于生物酶具有最适的反应温度，在此温度下生物酶的反应活性最高，因此当温度低于最适温度，酶的活性没有完全激活，随着温度的逐渐上升，酶的活性逐渐提高.当温度超过了最适温度，生物酶就逐渐地失活、变性，其催化效率就下降了，相应的降解率也会逐渐下降［14］.

2.4.2 pH对降解的影响

在无菌条件下，取5mL QA菌悬液接种到含有30mL制药废水的无机盐培养液中（培养液总体积为50mL），设置pH梯度为5、6、6.5、7、7.5、8、9.将培养液置于恒温摇床30℃振荡培养3d，每个pH条件下做3个平行样品.分别测定实验前后培养液的COD，根据实验前后的COD值得出QA菌株在不同pH条件下对制药废水的降解率.实验结果如图2所示.

图2 pH对菌株降解废水的影响

由图2可知，在pH为5时，废水降解率为50.2%，当培养液pH为7时，废水的降解率达到最大值79.1.在pH＝5～7范围内，QA菌株对制药废水的降解率随着pH的升高而逐渐增大，pH为7时降解率最大.pH从7到9这个区间随着pH升高，QA菌株对制药废水的降解率逐渐下降，至pH为9时，降解率降到了最低值42.8%.说明pH为7时是QA菌株对废水的降解率的最优条件.这是因为pH也是影响生物酶活性的一个重要因素.pH值的改变会影响生物酶活性中心的必须基团的解离程度，同时也影响底物和辅酶的解离程度，从而影响酶分子对底物分子的结合和催化，当pH过小或过大时都会使酶蛋白变性而失活［15］.因此，pH为7时是此菌株的最适pH.

2.4.3 底物体积分数对降解的影响

在无菌条件下，取5mL QA菌悬液接种到含有制药废水（10、15、20、25、30、35、40mL）的无机盐培养基中（培养液总体积为50mL），调节pH至7.0.此时培养液底物体积分数依次分别为200、300、400、500、600、700和800mL／L.将培养液置于摇床内30℃恒温振荡培养3d，每个底物体积分数条件做3个平行样品.分别测定实验前后培养液的COD，计算QA菌株在不同底物体积分数条件下对废水的降解率.实验结果见图3.

图3 底物体积分数对菌株降解废水的影响

由图3可知，在底物体积分数从200mL／L逐渐增大到600mL／L的过程中，QA菌株对制药废水的降解率也在逐渐增大，从200mL／L时的38.1%增大到了600mL／L的77.7%.当底物体积分数超过了600mL／L后，QA菌株对制药废水的降解率急剧的下降.至800mL／L时，废水的降解率为1.2%，几乎为零.因此，制药废水体积分数在600mL／L时是QA菌株的最适底物体积分数.当废水体积分数超过最适体积分数后，废水对QA菌株降解的影响很大，这可能与菌株的生长繁殖受到废水中各种高含量物质的影响有关［16］.

2.4.4 制药废水降解曲线

由上述最适降解条件实验结果可知，30℃，pH为7.0、底物体积分数600mL／L，是QA菌株对制药废水的降解的最适条件，菌株对废水的降解效果好.因此在30℃、pH为7.0、底物体积分数为600mL／L的实验条件下，测定QA菌株制药废水的降解曲线.每隔10h测定培养液的COD值.QA菌株对制药废水降解率随时间的变化结果如图4所示.

图4 最适条件下制药废水降解曲线

由图4可以看出，在QA菌株降解制药废水的最适条件下，培养的前30h，废水的降解率不到5.0%，而且基本保持不变.这是由于刚刚接入到制药废水的QA菌株需要先适应新环境，即进入微生物的停滞期［17］.从30h到70h，QA菌株对废水的降解率越来越大，曲线的斜率也越来越大，至70h时，对废水的降解率达到了77.3%.因此，30h到70h之间是QA菌株生长速率最快、代谢最为旺盛、酶系统最为活跃、细菌数量最多的对数生长期.70h至90h间，QA菌株对制药废水的降解率基本维持稳定，变化幅度很小，即此时QA菌株进入到了稳定期.此阶段微生物细胞代谢产物积累达到了最高峰，营养物比例失调、有毒有害代谢产物积累、pH等理化指标已不适宜微生物生长.如果继续培养，其生存环境对继续生长越来越不利、细胞的分解代谢大于合成代谢，最终会导致大量细菌死亡.因此，在QA菌株降解制药废水的最适条件下，想让QA菌株降解某制药厂废水效果达到最佳，最好的时长是70h.

3 结 论

本文采用了微生物目标菌株筛选的经典方法，即选择性富集、多次驯化培养、划线分离与纯化得到目的菌株，最后对目的菌株进行鉴定和描述，以及研究其最佳降解条件.实验结果表明从求索溪污泥中筛选出的QA菌株对制药污水的降解能力最强，最佳降解条件为：温度为30℃、pH为7，底物体积分数为600 mL／L，其最终降解率为78.6%（80h时），该降解能力比较强，但还可以对QA菌株进行诱变处理，以进一步提高其降解能力.

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