归肾育宫汤对免疫性卵巢早衰小鼠外周血清性激素的影响＊

符小航 连李斌 康汝光 车虹彩 仝腊娟 杨鉴冰 崔晓萍 贺丰杰

陕西中医学院第二附属医院（咸阳712046）

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指女性在青春期后，40岁前发生的非生理性的月经停止，伴有潮热、原发或继发不孕、全身和生殖器萎缩的疾病［1］。本病在一般人群中发病率为1%～3%，在闭经者中占2%～10%，近年来发病率有逐年上升的趋势［2］。目前西医主要以雌激素替代疗法为主，但长期应用会增加患者罹患乳腺癌和子宫内膜癌的风险，故临床应用受到限制。中医药治疗本病疗效确切且无明显副作用，中药有多系统、多环节的整体调节作用，具有明显的调节内分泌能力，特别是能提高卵巢性激素受体的含量［3］。归肾育宫汤是陕西省名中医杨鉴冰教授依据“肾主生殖”理论，结合多年临床经验创立的治疗卵巢早衰的经验方，临床疗效显著，但其作用机制目前尚不清楚。本实验拟通过观察归肾育宫汤对免疫性卵巢早衰小鼠外周血清性激素的影响，揭示该方的作用机制，为卵巢早衰的中医药治疗提供可靠的临床依据。

1 材 料 1．1 动物 SPF级雌性昆明小鼠60只，体重（20±5）g，合格证号：SCX（陕）2007-001，西安交通大学实验动物中心提供。

1．2 药物及试剂 结合雌激素片：新疆新姿源生物制药有限责任公司，批号：20130402；归肾育宫汤组方：熟地、紫河车、杜仲、鹿角霜、山萸肉各10g，枸杞子、川断各12g，制首乌、山药、茯苓、鸡血藤、焦山楂各15g，菟丝子20g，炙甘草6g，所有中药由陕西中医学院第二附属医院中药房提供；透明带多肽3（ZP3）：美国 GenScript公司，纯度98．1%，批号：5004321-1；弗氏完全佐剂：美国Sigma公司产品；弗氏不完全佐剂：美国Sigma公司产品；卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、雌二醇（E2）、孕酮（P）、透明带抗体ELISA试剂盒，上海西唐生物科技有限公司；水合氯醛：上海山浦化工有限公司

1．3 仪器与设备 酶标仪：ELX808，美国Bio-Tek公司；光学显微镜：蔡司光学仪器（上海）公司。

2 方 法 2．1 POF模型制备 取1．4445mgZP3透明带多肽粉末，加入1mL三蒸水配置成溶液，每1mL溶液与弗氏完全佐剂按1：1比例配制成免疫试剂，与弗式不完全佐剂按1：1配制成免疫强化试剂，每只小鼠取0．1mL免疫试剂多点注射双后脚掌及腹腔，14d后以免疫强化试剂0．1mL多点注射小鼠双后脚掌及腹腔加强免疫。

2．2 分组及给药 60只小鼠随机分为空白组、模型组、雌激素组、归肾育宫汤大剂量组、归肾育宫汤中剂量组、归肾育宫汤小剂量组。雌激素组用结合雌激素片按0．3mg／人／d，根据小鼠与人的体表面积进行换算；各中药治疗组药物均水煎后去滓，浓缩，调配浓度，使小剂量归肾育宫汤溶液每毫升含生药0．525g；中剂量归肾育宫汤溶液每毫升含生药1．05g；大剂量归肾育宫汤溶液每毫升含生药2．1g。每只小鼠灌胃量均为1mL，空白组、模型组灌胃相同量蒸馏水，连续灌胃4周，每周休息1d。

2．3 动情周期观察 用生理盐水润湿棉签，取阴道脱落细胞涂于载玻片上，自然干燥后甲醇固定1h，Giemsa染色20min，0．01MPBS冲洗3次，光学显微镜观察。本实验采用的小鼠正常性周期为4～6d，包括动情前期（9～18h）、动情期（6～12h）、动情后期（30～48h）和动情间期（36～42h）。造模之日起，每天早上8：00阴道脱落细胞涂片观察小鼠动情周期的变化，以出现动情周期紊乱表示造模成功。

2．4 外周血清性激素的检测 动物股动脉取血，3000转／min，离心15min，取上清，按试剂盒说明书用ELISA法检测外周血清性激素卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、雌二醇（E2）、孕酮（P）水平。

2．5 统计学方法 采用SPSS18．0统计软件，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，多组间比较用方差分析，组间比较用SNK法，以P＜0．05为差异有统计学意义。

3 结 果 3．1 归肾育宫汤对小鼠外周血清卵泡刺激素和黄体生成素的影响 与空白组比较，模型组卵泡生成素和黄体刺激素显著升高（P＜0．05）；给药治疗后与模型组比较，雌激素组、归肾育宫汤大、中、小剂量组卵泡刺激素和黄体生成素显著降低（P＜0．05）；与雌激素组比较，中、小剂量组卵泡刺激素升高，大、归肾育宫汤中剂量组黄体生成素降低（P＜0．05）；与大剂量比较，中、小剂量组卵泡刺激素和黄体生成素均升高（P＜0．05）。

表1 各组小鼠外周血清卵泡刺激素和黄体生成素水平比较（±s）

表1 各组小鼠外周血清卵泡刺激素和黄体生成素水平比较（±s）

注：与空白组比较，△P＜0．05；与模型组比较▲P＜0．05；★与雌激素组比较P＜0．05，☆与大剂量组比较P＜0．05。

组 别 n 卵泡刺激素（IU／L） 黄体生成素 （ng／L）10 0．64±0．01 166．14±3．03模型组 10 0．94±0．01△ 255．38±4．85△雌激素组 10 0．69±0．02▲ 186．27±3．63▲归肾育宫汤大剂量组 10 0．64±0．02▲★ 167．66±1．53▲★归肾育宫汤中剂量组 10 0．70±0．01▲☆ 173．12±3．43▲★☆归肾育宫汤小剂量组 10 0．73±0．03▲☆ 182．76±2．64空白组▲☆

3．1 归肾育宫汤对小鼠外周血清雌二醇和孕酮的影响与空白组比较，模型组雌二醇和孕酮显著降低（P＜0．05）；给药治疗后与模型组比较，雌激素组、归肾育宫汤大、中、小剂量组雌二醇和孕酮显著升高（P＜0．05）；与雌激素组比较小剂量组雌二醇和孕酮降低，大量组孕酮升高（P＜0．05）；与大剂量比较，中、小剂量组雌二醇和孕酮均降低（P＜0．05）。

表2 各组小鼠外周血清雌二醇和孕酮水平比较（±s）

表2 各组小鼠外周血清雌二醇和孕酮水平比较（±s）

注：与空白组比较，△P＜0．05；与模型组比较▲P＜0．05；◇与雌激素组比较P＜0．05，◆与大剂量组比较P＜0．05。

组 别 n 雌二醇（ng／L） 孕酮（pmol／L）10 5．41±0．26 154．32±3．20模型组 10 2．84±0．08△ 126．85±3．22△雌激素组 10 5．47±0．27▲ 144．18±2．54▲归肾育宫汤大剂量组 10 5．62±0．30▲ 150．98±2．13▲◆归肾育宫汤中剂量组 10 5．29±0．11▲◇ 144．58±3．30▲◇归肾育宫汤小剂量组 10 4．88±0．17▲◇◆ 137．32±2．49空白组▲◇◆

4 讨 论 本病属中医学“血枯”、“血隔”、“闭经”、“不孕症”等范畴。《内经》云：“女子七岁，肾气盛，齿更发长；二七而天癸至，任脉通，太冲脉盛，月事以时而下；……七七任脉虚，太冲脉衰少，天癸竭，地道不通，故形坏而无子也”。《医学正传·妇人科》载：“月经全借肾水施化，肾水既乏，则经血日以干涸。”可见妇女月经的生理活动，其主导在肾，调节在天癸，约束在冲任，藏泻在胞宫，所以说其根在肾［4］。杨鉴冰教授依据“经水出诸肾”、“肾主生殖”的理论创立了归肾育宫汤，临床疗效确切且无副作用［5-6］。为进一步探明归肾育宫汤的作用机制，本实验根据自身免疫异常的机制采用透明带多肽成功复制了POF小鼠动物模型，模型成功后可见卵泡刺激素（FSH）及黄体生成素（LH）升高，FSH水平明显高于LH，而雌二醇下降。经归肾育宫汤给药治疗后，可见大中剂量组小鼠血清FSH、LH水平显著降低，雌二醇和孕酮含量明显升高，对小鼠POF有显著的治疗作用，且疗效优于雌激素，表明归肾育宫汤可能通过调节性激素水平对POF起到治疗作用，但具体的作用机制还有待进一步研究。

［1］ 杨 冰，叶 元．卵巢早衰［J］．华夏医学，2004，4（19）：833-835．

［2］ 杨业洲．卵巢早衰［M］．北京：人民卫生出版社，2004：102-108．

［3］ 姚石安．卵巢早衰中医证治需注意哪些方面［J］．中医杂志，1998，39（5）：313．

［4］ 贺爱华．中医论治卵巢早衰［J］．吉林中医药，2007，27（7）：1-2．

［5］ 任洁宁，杨鉴冰．杨鉴冰教授治疗卵巢早衰用药经验介绍［J］．现代中医药，2009，25（3）：1-2．

［6］ 杨鉴冰．补肾育宫汤配合西药治疗卵巢早衰22例［J］．陕西中医，2009，30（7）：773-774．