阿维菌素在鱼类体内的药动学及残留检测概况

韩 飞，张 曼，张 周，王晶钰

（1.杨凌职业技术学院，陕西杨凌712100；2.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌712100）

1976年，日本北里研究所研究人员在链霉菌的发酵菌丝中发现一种由8个结构相近的同系物组成的混合物，这种产物对动植物体表上寄生的节肢动物、线虫类害虫具有极强的驱杀作用，后来称为阿维菌素［1］。在欧美发达国家，阿维菌素被发现以后，便被广泛地用于农作物的害虫防治。20世纪80年代，阿维菌素菌种被引进我国，1993年由北京农业大学首次研制成功。

阿维菌素（avermectin，AVM）类药物是由阿维链霉菌产生的一种新型大环内酯类药物，主要用于抗寄生虫。它由一类结构相似的混合物组成，共有8个组分，分别命名为 A1a、A1b、A2a、A2b、B1a、B1b、B2a和B2b。其中 A1a、A2a、B1a和B2a为4个大量组分，含量在80%以上；A1b、A2b、B1b和B2b为4个少量组分，含量在20%以下［2］。由于AVM具有新颖的化学结构、独特的作用机制，以及优良的驱虫效果和较高的生物安全性，已被行业内看作是目前应用最优秀、最具有市场销量的一种新型、广谱、高效、安全的抗体外、体内寄生虫药物，是抗寄生虫药物研究中，近几十年来最为杰出的研究成果［1-3］。它在畜牧业上已经得到了广泛的应用，如阿维菌素复方缓释制剂可以杀死绵羊的多种体内、体外寄生虫［4］。阿维菌素注射液以0.2mg/kg皮下注射，对牛的皮蝇蛆、常见胃肠道线虫及吸血虱均具有良好的驱杀效果［5］。目前AVM已经广泛地应用于水产养殖中的寄生虫病防治，但过量的阿维菌素又会对鱼体产生毒害作用，甚至导致鱼类死亡。因此，研究阿维菌素对鱼体的影响不仅对深入了解其作用机制具有指导意义，而且对鱼类的健康养殖也具有实用参考价值［6］。本文通过对阿维菌素的作用机理、药物毒性、药动学、鱼类养殖应用和残留检测方法等方面进行概述，对阿维菌素在鱼类等水生生物的安全性及其在水生生物中的残留检测方法进行了重点分析，旨在为评价阿维菌素对水生生物的毒害、控制药物残留研究提供参考。

1 阿维菌素的理化性质

阿维菌素是无味、淡白色结晶粉末，熔点为155℃～157℃，蒸气压为1.5×10-9Pa，比重为1.16g/cm-3±0.05g/cm-3（21 ℃）。AVM 是一类脂溶性的药物，可溶于多种有机溶剂中，如21℃时，溶解度为丙酮 100g/L，正丁醇 10g/L，氯仿25g/L，环己烷6g/L，乙醇20g/L，异丙醇70g/L，甲醇19.5g/L，甲苯350g/L，煤油0.5g/L，AVM水中的溶解度为7.81μg/L。

2 阿维菌素的作用机理

阿维菌素与寄生虫体内特异性位点相互作用产生一系列的生化和电生理反应。最初解释AVM的作用机制为，AVM以及其类似物可作为γ-氨基丁酸（gamma amino acid butyric acid，GABA）的激动剂，从而引发突触前大量释放GABA，GABA能够增加膜对Cl-的通透性，导致中枢神经及神经-肌肉间相互传导受阻。而且GABA还可与次级神经元的细胞膜或效应器的细胞膜结合，产生更高强度、长时间的抑制反应，使寄生虫因麻痹而死亡，从而达到杀虫效果。随后的相关研究发现，在较低浓度时，AVM也可引起Cl-通道开放。其活性主要是AVM能发生立体选择性反应，调节谷氨酸门控Cl-通道，使得Cl-大量流入细胞内，膜电位维持在超极化状态，正常的电位不能释放，神经传导受阻，最终引起虫体的麻痹死亡［7］。GABA在这个过程中起着关键性作用，一些缺少GABA神经传导介质的生物就对AVM不敏感。Campbel L等［8］研究表明，AVM对绦虫和吸虫无效，就与其体内缺少GABA神经传导的相关介质有关，而且在绦虫和吸虫体内还缺乏受谷氨酸控制的Cl-通道。

3 阿维菌素在水产动物的药动学研究

在体内，AVM的药物动力学具有一定的线性动力学特征。Vanden H W等［9］报道AVM在大鳍鳞鳃太阳鱼体内的消除规律和生物富积，结果发现大鳍鳞鳃太阳鱼的内脏和肌肉及其他组织的消除规律一致，而AVM在内脏和肌肉的生物富积系数分别为28μg/kg和84μg/kg，可以看出AVM不易在水生生物富积。Katharios P等［10］按照100μg/kg腹腔注射研究了AVM在海鲷体内的药代动力学，2h后达达到高峰，浓度高达308.4μg/kg，AUC也达到10 700ng·h/mL，其消除半衰期为15.37h，表面AVM具有较高的较快的消除半衰期和生物利用度。张启迪等［11］研究了AVM在鲟鱼体内的生物富集和生物消除规律，发现低剂量的AVM在鲟鱼肌肉中的生物富积系数、半衰期、吸收速率和消除速率分别为42μg/d、4.95h、5.9ng/d、0.14ng/d；高剂量的AVM在鲟鱼肌肉中的生物富积数、半衰期、吸收速率和消除速率为 41μg/d、4.33h、6.53ng/d、0.16ng/d。结果表明，鲟鱼对水中的AVM吸收较快，而且AVM在鲟鱼体内消除迅速，AVM的生物富集系数值较低。

但是，在其他水生生物中，AVM在其体内停留时间较长。Sevatdal S等［12］对鲑鱼口服甲氨基阿维菌素后的药动学做了研究，鲑鱼口服甲氨基阿维菌素7d后其血液、黏液和肌肉中甲氨基阿维菌素达到最大浓度到128、105、68μg/kg，77d后降至检测限以下。肌肉、血液和黏液的消除半衰期分别为9.2、10.0、11.3d。Shaikh B等［13］报道了虹鳟鱼单次口服0.1mg/kg体重氚标记阿维菌素后其消除规律，直到停药后第42天肌肉（包括皮）中阿维菌素残留浓度还有3.49μg/kg，并在给药后第35天，肌肉中检测到占总残留65%的氚标记伊维菌素代谢物。这些研究显示，阿维菌素在一些水生生物中消除较慢，残留严重，在使用时应注意降低浓度或者适时收获以延长其降解消化时间。秦晓改等［14］研究药浴的阿维菌素在草鱼体内的药物代谢动力学，用初始质量浓度为0.3μg/L的阿维菌素水溶液药浴草鱼，得出主要药动学参数如下：t1/2α34.2h，t1/2（ka）15.61h，消t1/2β163.22h，AUC 2 486.02μg·h/L，Tpeak40.75h，Cmax11.92μg/L。药浴后72h草鱼肌肉、肝脏、肾脏和鳃中阿维菌素含量均达到最高值，其中肝脏中的含量最高，达到17.8μg/kg，血浆中阿维菌素含量在48h达到最高（11.2μg/kg）。肝脏、肾脏和鳃组织中阿维菌素含量均呈“双峰”曲线。草鱼血浆及各组织中阿维菌素在给药后24d未检出，所以，对草鱼单剂量（0.3μg/L）药浴阿维菌素后的休药期为24d。除此之外，陈静［15］研究了阿维菌素在鲫鱼肌肉中的消除规律，结果表明阿维菌素单次泼洒给药后，鲫鱼肌肉对AVM吸收较快，但蓄积浓度不高，滞留时间较长，消除较为缓慢。邢丽红等［16］研究了阿维菌素在鲈鱼组织中的富集消除规律，表明AVM在鲈鱼组织中达到的最高浓度由大到小依次为肝脏、血液、鳃和肌肉，肝脏对AVM的富集能力较强，而肌肉对AVM的富集能力较弱。各组织对AVM的消除能力也不同，肌肉、鳃、肝脏、血液对AVM 的消除半衰期为6.9、9.5、8.2、10.7d。

以上研究显示，AVMs作为脂溶性药物，给药后可以很好的被生物体吸收，从药物代谢动力学来说，其表观分布容积大，在体内持续时间长，消除相对比较缓慢，停药时间相对要早一些。除此之外，AVMs在生物体内的药代动力学参数也受到药物本身的性质、动物种类、饲养环境、给药途径、给药剂量、pH、温度、盐度等多因素的影响，在使用时应结合实际情况灵活变动给药量和停药时间，这样才能使AVM发挥最大的防治效果。

4 阿维菌素对水产动物的毒性作用

AVM被广泛应用于水产养殖中，对鱼、虾、鳖的寄生虫病防控有较好的疗效，能驱杀鱼体或鳃上寄生的鱼虱［17］、锚头鳋、车轮虫、指环虫、线虫幼体等寄生虫，Hemaprasanth K P等［18］发现阿维菌素可以治疗印度的南亚野鲮中的Argulus siamensis感染。AVM属于生物源农药。但是，按世界卫生组织（WHO）五级分级标准，VM仍属高度化合物，其无论是作为农药还是兽药，都会排放到环境中。进入水体中的AVM会对水生环境产生不利影响，由于其高毒性，甚至在很低的浓度下，对水蚤和鱼类也能产生强烈的毒性作用。

阿维菌素对无脊椎类动物特别是甲壳动物毒性较大，其中幼虾对阿维菌素最为敏感。同时，AVM对甲壳类糠虾也具有广泛毒性。一般来说，AVM对蚤类的半数致死量（LC50）为0.34μg/L，对同形蚤最大效应浓度（EC50）为 5.1ng/L［15］。如果阿维菌素进入池塘淤泥，其毒性则大大降低，应用标记［3H］的AVM放射性同位素测定其对蚤类的LC50为39μg/L，这一数据是在水中的100倍［15］。

AVM对鱼类也有毒性，毒性比对蚤类的毒性大约高10倍［6］。Katharios P等［19］发现在阿维菌素用于海鲷的急性毒性试验中，腹腔给药0.4mg/kg～0.8mg/kg时会对鱼体神经系统有明显的毒害作用，例如食欲减退，体色发暗。阿维菌素对中华鰟鮍也有急性毒性，含量为6%的伊维菌素对中华鰟鮍的24、48、72、96hLC50分别为71.68、45.04、37.81、35.69μg/L，安全浓度为0.001 3μg/L［20］。但是通过对淡水鱼类进行21d的毒性试验，Tisler T等［21］发现斑马鱼对阿维菌素不敏感。AVM对鱼类的急性毒性见表1。AVM对贝类没有表现出显著毒害作用。

表1 AVM对鱼类的急性毒性Table 1 AVM acute toxicity to fish

5 AVM的最高残留限量及检测方法

进入水体的AVM除了对敏感的水生蚤类、虾类产生影响，也会对以这些生物为食的其他生物如某些鱼类产生影响，继而可能对河流、湖泊，甚至海洋生态系统产生不良影响。研究AVMs的检测方法，确定其最高残留限量，优化检测方法，对于减少阿维菌素的残留和其对环境的影响有重要意义。日本《肯定列表制度》规定，鳗鱼中阿维菌素和多拉菌素的残留限量为5μg/kg。然而我国对水产品中AVM的限量标准还未做规定，而且不论在畜产品还是水产品中均没有高效液相色谱荧光检测方法的相应标准颁布。而在阿维菌素的检测中，由于其熔点为155℃～157℃，蒸气压低于2×10-7，加上其有较高的分子质量和较多的糖链，极难气化，这些性质决定了无法使用气相色谱分析，其主要检测方法是高效液相色谱法和免疫学方法。阿维菌素在水产养殖上使用越来越多，但其残留检测方法及药代动力学研究多见于畜产品和农产品，而在水生生物中，此类研究相对较少。

5.1 液相色谱-荧光检测方法（HPLC-FLD）

阿维菌素类药物具有共扼二烯结构，在λ＝245nm处有强紫外吸收，但在此波长区域，维生素、脂类、核酸、皮质激素等众多内源性物质也呈现紫外吸收特征。而这些内源性物质净化困难，会严重干扰阿维菌素类的紫外光谱检测。荧光检测方法可弥补紫外测定方法的不足，其可使检测的选择性和灵敏度显著提高，检测限较紫外约低1个～2个数量级，可满足阿维菌素残留分析需要。但是阿维菌素本身没有对称共扼结构，不能直接用荧光检测器检测，只有经荧光衍生化后，生成具有对称共辘的苯环结构才能发射荧光，由此选择适宜的荧光衍生化试剂、反应条件及净化条件都显得非常重要。

邢丽红等［22］研究报道了鲈鱼组织中阿维菌素、伊维菌素残留的HPLC-FLD法，阿维菌素和伊维菌素衍生化产物的浓度与峰面积在0.5ng/mL～200ng/mL范围内有很好的线性关系。添加水平为1μg/kg～10μg/kg，阿维菌素和伊维菌素的平均回收率在80.6%～88.0%和78.8%～82.8%之间，阿维 菌 素 的 检 出 限 为 0.1μg/kg，伊 维 菌 素 为0.2μg/kg。张启迪等［23］研究报道了鱼肌肉组织中阿维菌素残留的高效液相色谱法测定，检测限为0.2ng/g，在5ng/g～100ng/g添加水平范围内，阿维菌素的平均回收率为87.4%～93.9%，日内变异系数为3.5%～5.3%，日间变异系数为4.8%～8.7%。周齐家等［24］建立了大黄鱼肌肉肝脏鳃和血液中阿维菌素的HPLC-FLD法，样品用乙腈提取，甲醇水解测定，结果表明阿维菌素在0.5μg/kg～50μg/kg范围内线性良好。检测限为肌肉0.5μg/kg，其他组织1.0μg/kg。使用 HPLC进行样品中阿维菌素残留检测时，多采用内标法定量和荧光检测法。根据阿维菌素的溶解性，用品都用有机溶剂进行提取，多使用乙睛和乙酸乙醋的。净化方法多用固相萃取杜，如碱性氧化铝柱和IAC柱。总的来说，HPLC-FLD法灵敏度高，方法稳定，精确度高，特异性强，检测限都能够低于最高残留限量（MRLs），适于进行确证性验证。

5.2 液相色谱-质谱检测方法（LC-MS-MS）

LC/MS法检测灵敏度高，方法简便，可同时检测更多种药物，减少了工作量，极可能成为阿维菌素多组分残留确证检测的最佳方法之一［25］。

张云等［26］用LC-MSVMS法同时测定鳗鱼组织中阿维菌素多残留量，外标法定量，样品经乙酸乙酯提取后，再经碱性氧化铝柱净化去脂，阿维菌素检出限为1.0μg/kg。在兽药制造环节，也要保证药品的浓度准确。兽药制剂加工的检测环节往往成了生产时效的一个关键瓶颈。通过试验阿维菌素高效液相色谱非标检测方法，缩短单个样品检测时间，降低检测成本和提高检测效率。胡全保等［27］选用岛津色谱柱：inertsil ODS-SP C18填料，250mm×4.6 mm（i.d），5μm 不锈钢柱，过滤器：滤膜孔径约0.45μm，进样器：50μL，流动相：甲醇∶水（86∶14），1.0mL/min，检测波长：245nm，得到的阿维菌素测量标准偏差≤0.0038；变异系数≤1.80；线性相关系数为0.999 5；平均回收率为99.5%，简便、准确、快速测定阿维菌素胡含量，适用于阿维菌素类制剂产品的含量测定和质量控制。

以上所述的阿维菌素在水生生物中检测方法主要包括液相色谱-荧光检测方法（HPLC-FLD）和LC-MS-MS法。AVM药物残留分析技术的发展趋势为免疫分析技术与仪器分析技术的联用、多残留分析技术、仪器分析方法、免疫分析方法等，以便在一个样本分析中尽可能获得更多的药物残留信息［28］。

6 小结与展望

随着水产养殖规模的扩大和集约化程度的提高，养殖用药不规范现象越趋严重，加之管理相对滞后，药物残留问题日益突出，逐渐成为社会关注的焦点。阿维菌素是微生物衍生物，作为天然产品，安全性相对较高，被视为目前最为优良、应用最广泛的兽用驱虫药［29］。但是，阿维菌素类药物由于具有脂溶性、体内代谢后大部分以原形排出及在环境中不易发生生物降解等特点，容易在水环境中储存和蓄积，使地下水受到威胁，影响土壤和水生环境中的生物。渔场中使用的具有预防作用的兽药大部分直接排入水中，影响水生生物健康，而渔场的污泥常被用做土壤调节剂，其中含有的阿维菌素进入农业生态系统，并产生与促生长调节剂和治疗性药物同样的转归。由于阿维菌素对一些水生生物具有毒性及潜在的影响，控制其对水环境的污染、检测其残毒，对保护生态环境、保护人类健康具有重要的意义。因此，建立准确检测和评价阿维菌素对水生生物的毒害的工作，具有环境效益和社会效益。

目前，我国对于阿维菌素类药物在水产养殖方面应用的研究相对较少，而且阿维菌素类药物对水生生物毒性的研究报道也不多，水生生物体内药物代谢动力学研究少，这在一定程度上制约着阿维菌素类药物在水产养殖中的安全使用。因此，加强阿维菌素类药物对水生生物毒性及在水生生物体内的药物代谢动力学研究是十分必要的，同时对我国水产养殖业持续发展具有重要的意义。

［1］Bowen J M.The avermectins complex：a new horizon in anthelintie therapy［J］.Vet Med Small Anim Clin，1981，76：165-166.

［2］扈洪波，朱蓓蕾，李俊锁.阿维菌素药物的研究发展［J］.畜牧兽医学报，2000，31（6）：520-529.

［3］Reddy P P.Avermectins［J］.Recent advances in crop protection，2013，13-24.

［4］王建培，欧阳五庆.阿维菌素复方缓释制剂在绵羊寄生虫病防治中的应用［J］.动物医学进展，2006，27（4）：102-106.

［5］游锡火.阿维菌素制剂的临床应用及特点［J］.动物医学进展，1999，20（4）：56-57.

［6］Novelli A，Vieira B H，Cordeiro D.Lethal effects of abamectin on the aquatic organisms Daphnia similis，Chironomus xanthus and Danio rerio［J］.Chemosphere，2012，1：36-40.

［7］Shoo P W L，Morzik H，Fisher M H.Strueture and activity of avermeetins and milbemycins in animal health［J］.Vet Parasitol，1995，59：139-156.

［8］Campbell W C，Benz G W.Ivermectin：a review of efficacy and safety［J］.J Vet Pharmacol Therap，1984，7（1）：1-16 .

［9］Vanden Heuvel W，Forbis A D，Halley B A.Bioconcentration and depuration of avermectin in the bluegill sunfish［J］.Environ Toxicol Chem，1996，15（12）：2263-2266.

［10］Katharios P，lliopoulou G，Antimisiaris S.Pharmacokinetics of avermectin in sea bream，Sparus aurata using adirect competitive ELISA［J］.Fish Physiol Biochem，2002，26：189-195.

［11］张启迪，丁双阳，邹 明，刘文华，刘焕奇.鱼肌肉组织中阿维菌素残留的高效液相色谱法测定［J］..中国兽医杂志，2008，44（8）：88-89.

［12］Sevatdal S，Magnusson A，Ingebrigtsen K.Distribution of emamectin benzoatein atlantic salmon （Salmo salar L）［J］.Vet Pharmacol Therap，2005，28：101-107.

［13］Shaikh B，Rummel N，Gieseker C.Residue depletion of tritium-1abeled ivermection in rainbow trout following oral administration［M］.Aquaculture，2007，272：192-198.

［14］秦改晓，徐文彦，艾晓辉，等.阿维菌素在草鱼体内的药物代谢动力学研究［J］.西北农林科技大学学报：自然科学版，2012，40（8）：13-20.

［15］陈 静.鲫鱼肌肉中阿维菌素类残留检测和消除规律研究［D］.重庆：西南农业大学，2008.

［16］邢丽红，孙伟红，冷凯良，等.阿维菌素在鲈组织中的富集及消除规律研究［J］.中国渔业质量与标准，2013（4）：63-69.

［17］Sommerville C.Efficacy of two avermectins，doramectin and ivermectin against Argulus siamensis infestation in Indian major carp，Labeo rohita［J］.Vet Parasitol，2012，190（1-2）：297-304.

［18］Hemaprasanth K P，Kar B，Garnayak S K，et al.Efficacy of two avermectins，doramectin and ivermectin against Argulus siamensis infestation in Indian major carp，Labeo rohita［J］.Vet Parasitol，2012，190（1-2）：297-304.

［19］Katharios P，lliopolou G J，Kapata Z K.Toxicity of intraperitoneally injected ivermectin in sea bream，Sparus aurata［J］.Fish Physiol Biochem，2001，25：99-108.

［20］封 琦，王建国，王 权，等.伊维菌素和阿维菌素对中华鰟鮍的急性毒性效应［J］.安徽农业科学，2012，40（32）：15729-15731.

［21］Tisler T，Kozuh Erzen N.Abamectin in the aquatic environment.Ecotoxicology.2006，15（6）：495-502.

［22］邢丽红，冷凯良，翟毓秀，等.鲈鱼组织中阿维菌素和伊维菌素残留的高效液相色谱荧光检测法研究［J］.海洋水产研究，2008，29：52-57.

［23］张启迪，丁双阳，邹 明，等.鱼肌肉组织中阿维菌素残留的高效液相色谱法测定.中国兽医杂志，2008，44：88-89.

［24］周齐家，王 军，牛素芳，等.大黄鱼4种组织中阿维菌素的HPLC-FLD方法的建立［J］.厦门大学学报：自然科学版，2013：433-436.

［25］何继红，申屠芬琴.阿维菌素类药物残留分析技术研究进展［J］.动物医学进展，2009，30（5）：98-100.

［26］张 云，江吕术，陈 蛆，等.液相色谱串联质谱法同时测定鳗鱼中阿维菌素和伊维菌素残留量［J］.分析试验室增刊，2008，27（21）：104-107.

［27］胡全保，丁培芳，韦元杰.阿维菌素检测条件的探究［J］.广东化工，2012（2）：195-197.

［28］李卫平.阿维菌素的研究进展［J］.中国药业，2012，21（19）：108-110.

［29］Demain A L，Importance of microbial natural products and the need to revitalize their discovery［J］.J Ind Microbiol Biotechnol，2014，41（2）：185-201.