内皮型一氧化氮合酶基因多态性对一氧化氮水平的影响

王 进，杜 波(综述)，单爱军(审校)

(暨南大学第二临床学院/深圳市人民医院急诊科，广东 深圳 518020)

一氧化氮(nitric oxide，NO)是一种重要的细胞间信号转导分子，参与体内各种生理、病理过程。NO体内合成的关键酶是一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)。NO的体内生理合成过程复杂：在氧分子、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)、四氢叶酸、血红素、黄素单核苷酸(flavinadeninedinucletide，FAD)、黄素腺嘌呤二核苷酸、(flavinmononucleotide，FMN)及钙调蛋白这些辅因子共同参与下，NOS利用L-精氨酸合成NO和L-瓜氨酸。NOS共三种亚型：内皮型一氧化氮合酶(endothelial NOS，eNOS)、神经型一氧化氮合酶(neuronal NOS，nNOS)和诱导型/免疫型一氧化氮合酶(inducible or immunological NOS，iNOS)[1]。其中，eNOS是由eNOS基因翻译、转录生成。eNOS基因多态性与临床疾病遗传易患性研究，已成为分子生物学和基因组学的重要研究热点。

1 NO

NO是一种亲脂性的气体分子，由一个氮原子与一个氧原子构成，它作为内皮衍生舒张因子，由美国三位科学家Robert、Louis和Ferid在1980年首次发现，当时他们发现NO对于调节血管张力和功能具有重要作用，后来进一步研究表明，NO还具有血管舒张、血压调节、血流调节、抗血小板聚集与黏附、抗血管平滑肌细胞增生、抗脂蛋白氧化、抑制多种缩血管因子效应等更重要的生物学作用；此外，NO在神经系统中可作为神经递质和神经调质而调节信息传递、激素分泌和维持睡眠-觉醒周期[1]。实际上，NO作为体内的重要生物活性物质，参与了机体多种生理功能与病理过程的调节。因此，NO的合成、释放异常，必然会导致多种临床疾病的发生、发展，尤其是心脑血管疾病。由于NO在生物体内半衰期短、代谢活跃，难以检测与调控，通过基因水平阐明NO代谢异常的发生机制十分必要。

2 eNOS

NOS存在三种同工酶：eNOS、nNOS和iNOS，前两者合称结构性NOS(constructive nitric oxide synthase，cNOS)。eNOS分布于血管内皮细胞，参与血管功能调节，nNOS位于中枢和周围神经细胞胞体内，后者作为神经递质与神经调质参与信息传递[1]，eNOS与nNOS在生理状态下持续表达，而iNOS主要存在于巨噬细胞等炎性细胞内，生理状态下不表达，当机体出现炎症、免疫反应时，诱导产生、释放大量NO[2]，致使组织损伤与细胞凋亡[3]。生理状态下，参与体内各种生理过程，尤其在心脑血管系统调节过程中，以eNOS最为重要，因此从分子生物学与遗传学角度上探讨eNOS基因多态性对体内NO水平的影响，对于临床多种疾病的病因学研究有着十分重要的意义。

3 eNOS基因多态性

3.1基因多态性 在人群中，个体之间的DNA序列有90%是一致的，差异仅占10%，而正是这些差异存在，才决定个体间表型特征的差别，如面貌、体质量、身高、血型、性别的不同，当然，这些DNA序列的不同，也同样会造成个体间对不同疾病易患性、对各种药物反应性的差别[4]，这些个体间DNA序列的差异，遗传学称基因多态性。大量研究表明，eNOS基因多态性可能影响体内NO水平，从而影响各种临床疾病的发生、发展[1]。

3.2eNOS基因多态位点 人类eNOS基因位于第7号染色体上的7q35～36区，整个基因跨距2.1 kb，含26个外显子和25个内含子，经转录、翻译及修饰后产生一个相对分子质量为135×103，含1203个氨基酸序列的eNOS。目前已发现eNOS基因多态性10余种，eNOS基因主要含大量单核苷酸多态性位点(single nucleotide polymorphisms，SNP)，另外，还有一个位于第4内含子区数目可变性串联重复序列多态性(variable number of tandem repeat,VNTR)和一个CA重复微卫星标记[1]。在这些多态性中，目前研究证实与NO的产生效率及临床各种疾病密切相关的有：4内含子区VNTR，据重复次数不同，有4次、5次和6次重复三种多态性，称4a/b/c多态性；位于启动子区的第786号位点的T置换为C，称T786C多态性；位于第7外显子区的第894号位点G置换为T，称G894T多态性[1]。

4 eNOS基因与NO水平

4.14b/a与NO eNOS基因第4内含子存在一个含27个碱基对的重复序列，该重复序列为[GAAGTCTAGACCTGCTGC(A/G)GGGGTGAG]，该序列第19号位点亦存在多态性，是A与G的置换，序列上绝大多数为5次重复，称4b，少数为4次重复，称4a。另外，尚有报道存在此6次重复(4c)，但因其在各种群中实属罕见，统计学上常可忽略。虽然27 bp VNTR在转录mRNA后被剪切，也不影响eNOS的结构，但此多态性可能通过干扰mRNA剪切效率或与其他功能位点连锁共同作用而影响NO水平[5]。对于4a等位基因对NO水平的作用，目前研究结果并不一致。Tsukada等[5]通过检测413名健康人eNOS基因4b/a多态性与血清一氧化氮代谢物(NOX)水平发现，4a/4a基因携带者的基础NO代谢物水平是28.8 mmol/L，4b/4a基因携带者的基础NO代谢物水平为31.4 mmol/L，而4b/b基因携带者NO代谢物水平为35.5 mmol/L，统计分析显示，4a/4a纯合子的血浆基础NO代谢物水平比4b/4b纯合子降低20%，这项研究表明：4a等位基因的携带显著降低体内NO代谢物水平，从而间接提示4a等位基因可能降低体内NO的产生水平。Yokoyama等[6]在进一步研究4b/a多态性与高血压遗传易患性关系的过程中，检测血浆NO代谢物水平，亦得出与Tsukada等[5]相似的结论。黄惠彬等[7]在研究eNOS基因多态性与高血压、糖尿病的关系时，同时测定空腹血清NOX水平，结果发现，在对照组内，aa+ab基因型空腹血清NOX显著低于bb基因型(P<0.05)，说明a等位基因的存在可能减少基础的内皮型NO释放。关于机制方面报道不多，Senthil等[8]在对美国墨西哥人群的离体脐静脉内皮细胞研究后发现，4a/4a纯合子细胞中eNOS mRNA表达水平最高，但eNOS蛋白水平与酶本身活性却有所降低，这种矛盾的出现，尚需进一步研究。

值得注意的是，Wang等[9]通过对33个产后胎盘进行检测发现，虽然携带4a等位基因的个体eNOS蛋白水平降低(0.48±0.11 vs 1.05±0.10,P<0.01)，但eNOS酶自身活性却大大提高，携带4a等位基因的酶活性高于非4a等位基因个体7倍[(4556.2±255.4) cpm/(mg·min) vs (621.8±180.5) cpm/(mg·min),P<0.01]，aa纯合子较bb纯合子NOX水平显著增高[(64.9±7.5) mmol/L vs (30.2±3.1) mmol/L]。但鉴于研究对象是离体的胎盘组织，其是否能代表在体组织，尚需要进一步研究明确。日本也有研究指出，抑郁症患者中4b/4b纯合子血浆NOX水平显著低于4a携带者[10]。Hassan等[11]学者的研究也支持此观点，认为4a等位基因可能通过影响eNOS基因启动子区的激活而提高NO水平。

4.2T786C与NO T786C(rs2070744)指位于eNOS基因启动子区第786位点的胸腺嘧啶(T)转换为胞嘧啶(C)。启动子直接与基因转录启动相关，故此部位核苷酸转换可能通过改变启动子区活性而影响体内NO生成效能[8]。为证明此观点，Nakayama等[12]学者对日本人群进行了研究，主要内容是eNOS基因启动子区三个多态位点(T786C、A922G和T1468A)与冠状动脉痉挛的关系，结果发现，冠状动脉痉挛患者eNOS基因启动子区突变的发生率显著高于对照组，采用多元Logistic回归分析逐步剔除其他因素后，T786C的突变显著降低eNOS基因启动子的活性(P<0.05)，而另外两个多态性位点则未见明显功能，位于启动区的T786C突变显著降低启动子区活性，影响eNOS基因转录的起始过程，eNOS合成减少，从而NO生成减少。Miyamoto等[13]对此作了进一步的机制学研究，他们从海拉细胞中纯化出一种复制蛋白A1，这种蛋白普遍存在于人体细胞中，尤以脉管系统的细胞最为丰富，它是一种单链DNA结合蛋白，在基因修复、复制及重组过程中具重要功能，Miyamoto等[13]通过体外试验发现，它可以特异性结合到存在T786C突变的eNOS基因启动子区，起到阻遏蛋白的作用，从而抑制启动子区活性，以致减少NO生成。李东宝等[14]在研究T786C多态性与高血压病关系时，同时利用硝酸还原酶法测定空腹血清NOX水平，结果显示高血压组CT+CC基因型和C等位基因频率显著高于对照组；TT基因型的血清NOX水平显著高于CT+CC基因型[(77.68±33.36) μmol/L vs (67.15±24.22) μmol/L，P<0.05]，从而得出结论：C等位基因携带者可能通过减少eNOs的释放参与原发性高血压发病。Ohtoshi等[15]在研究糖尿病与eNOS基因多态性关系时也有相似发现，在糖尿病患者中，携带C等位基因与不携带C等位基因相比，血清NOX水平显著降低。

然而，对此亦存在不同观点。Senthil等[8]对美国墨西哥人群的离体脐静脉内皮细胞研究中，同时测定eNOS mRNA水平、eNOS蛋白水平、催化活性以及NOX水平，结果通过方差分析得出结论：CC基因型携带者的eNOS mRNA水平比CT或TT基因型的显著降低(0.07±0.04 vs 0.20±0.07，0.18±0.05，P<0.05)，但三者之间eNOS蛋白水平、催化活性以及NOX水平并未见明显差异，但由于他们的研究中样本量较小，出现CC纯合子的个体仅有3个，是否可代表全体人群，尚不能过早下结论。Ikenouchi-Sugita等[10]对抑郁症患者研究中发现，TT纯合子血清NOX水平比G纯合子显著增高。Salimi等[16]在针对冠状动脉粥样硬化与T786C的研究中发现，在对照组及研究总人群中，786C携带者具有更高的血清NOX水平，然而在冠状动脉粥样硬化病例组中，并未发现T786C多态性与NOX水平的相关性。

有报道称[11]，T786C位点与4b/a位点存在连锁不平衡现象，即4a等位基因与786C突变存在重要的连锁效应。Hassan等[11]在研究eNOS基因多态性与脑小血管疾病的过程中，共招募病例组300例和对照组600例，使用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法检测eNOS基因4b/a和T786C位点，使用格里斯法测定血清NOX水平，结果发现，T786C可以影响血清NOX水平，但必须当4a等位基因存在时，此种影响才能表现出来，4a等位基因的存在可能通过激活启动子区活性而升高NO水平。

4.3G894T与NO G894T多态位点位于eNOS基因第7外显子第894位点(rs1799983)，由G置换为T，将使转录翻译后的eNOS的第298氨基酸位点的谷氨酸(Glu)被替换成天冬氨酸(Asp)，因此习惯上又称之Glu298Asp多态性。由于G894T多态性涉及所编码氨基酸序列的变化，相关研究和报道较多。Veldman等[17]为了探索G894T多态性与NO水平的关系，针对41名健康个体，经桡动脉先后以三种不同速度输入NOS抑制剂，即N-单甲基-L-精氨酸(L-NMMA)，观察试验对象前臂血流变化情况，结果发现，含298Asp个体对L-NMMA反应显著降低，由此推断，894T多态性可能降低基础NO水平。印度有研究表明[18]，在冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)患者中，GG纯合子血清NOX水平显著高于GT或TT者(P<0.01)。Senthil等[8]发现，含894T基因转录的eNOS mRNA量增多，但eNOS蛋白的量及活性均降低，体内NOX的量亦随之降低。有研究表明，由298Asp和298Glu构成的eNOS，两者米氏常数(Km)和酶促反应的最大速度(Vmax)是相同的，此部位的氨基酸替换是发生于蛋白质外表面的回文结构中，并不会干涉酶的活性中心及酶的二聚化过程[19]。Tesauro等[20]通过细胞转染技术研究发现，经786C等位基因转录、翻译后生成的带有298Asp的eNOS更易被内源性蛋白酶裂解，生成100×103和35×103的两个片段，而298位为Glu的eNOS并不会被裂解，从而可以说明突变后生成的eNOS自身稳定性下降，进而影响体内NO水平。Krolewski等[21]发现，Glu298Asp突变造成氨基酸改变后，致使原本局部α螺旋结构更为紧密，从而影响蛋白质功能及NO水平。

然而，目前已有的研究和报道并不都是一致的。Gad等[22]在研究G894T多态性与急性心肌梗死的过程中发现，在埃及人群中，并未出现G894T多态性与血清NOX水平有相关性。Golser等[23]研究了Glu298Asp突变对纯化重组eNOS在酵母中表达功能的影响，并未发现其对eNOS酶的功能造成影响，因此无法认为G894T多态性导致内皮功能失调。但是，该研究中的实验系体外实验，不能肯定其反映了人体的真实生理状况。此外，还有相反的观点，Yoon等[24]在进行冠心病患者的血清NOX与eNOS基因多态性关系研究中发现，在健康对照组中，GT+TT的个体，其血清NOX水平显著高于携带GG基因的个体(136.1 mmol/L vs 64.5 mmol/L，P=0.001)，而在冠心病组中却未见此种差别。

5 结 语

这些基因多态性的发生可能造成基因在翻译、剪接、转录及修饰过程中受到影响，从而改变eNOS蛋白的水平或活性，使血浆中内皮源性NO水平变化。值得注意的是，体内NO水平的高低并不仅仅受到eNOS的影响，还受nNOS、iNOS影响，此外也受到疾病状态及药物影响，如冠心病时使用的NO释放制剂(硝酸甘油等)。目前，已知的对于eNOS基因多态性的功能研究并不一致，其原因推测可能除与种族引起遗传差异或饮食、环境因素有关外，还存在其他众多机制的影响，值得进一步探讨。

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