百草枯对肺组织细胞凋亡的影响

白 雪，盛英杰(综述)，戢新平(审校)

(中国医科大学附属盛京医院 1急诊科， 2第二呼吸内科,沈阳 110004)

百草枯(Paraquat，PQ)又名对草快，其20%的溶液称克无踪，化学名为1，1′-二甲基-4，4′-联吡啶阳离子盐，分子式C12H14N2Cl2，是一种有机杂环类触杀、灭生型高毒性除草剂。百草枯接触土壤后迅速失活，对环境无污染，其应用于农业生产已有100多年的历史。人类误服百草枯后，无特效解毒剂，中毒死亡率极高，其主要临床症状早期为多脏器功能衰竭，后期不可逆性肺纤维化。

百草枯具有与二胺、多胺及二胺二硫胱胺类似的结构，因而可与胺类物质竞争细胞膜上能量依赖性多胺摄取受体，进而被细胞摄取。这种转运系统主要存在于肺泡Ⅰ、Ⅱ型上皮细胞及Clara细胞中[1-2]，巨噬细胞、内皮细胞及核间质细胞无此系统[3]。百草枯的选择性聚集导致肺内浓度是血液浓度的10～90倍[4]。

1 百草枯对肺泡上皮细胞和肺血管内皮细胞的影响

研究发现，百草枯最先损伤肺泡Ⅰ型上皮细胞，后导致肺泡Ⅱ型上皮细胞水肿变性、肺毛细血管内皮细胞损伤，血管通透性增加[5]。Chen等[6]研究发现,百草枯可诱导大鼠肺泡上皮细胞凋亡，而姜文等[7]发现百草枯可诱导大鼠肺微血管内皮细胞凋亡，提示细胞凋亡参与百草枯诱导的急性肺损伤。

百草枯诱导肺泡上皮细胞和肺血管内皮细胞凋亡可能与下列因素有关：①氧化损伤。百草枯二价阳离子(PQ2+)+还原性辅酶Ⅱ→PQ++辅酶Ⅱ，PQ+进入细胞内，PQ++分子氧→PQ2++超氧阴离子(O2-)，O2-在超氧化物歧化酶的作用下，形成过氧化氢(H2O2)，H2O2在Fe2+催化的Fenton型Haber-Weiss反应中形成毒性更强的自由基，如羟自由基(OH-)[8],上述反应产生的氧自由基(如O2-、H2O2、OH-等)诱导细胞凋亡的发生。②钙稳态失衡。曹钰等[9]向小鼠腹腔内注射百草枯，观察不同时间点肺组织细胞内钙离子浓度变化及肺损伤程度，结果发现与阴性组相比，肺组织细胞胞质内钙离子的浓度显著升高，以第2～4日明显。百草枯中毒时，可出现细胞内及线粒体内钙超载，随后发生的一系列凋亡改变，参与了肺组织细胞凋亡机制的形成[10]。③线粒体损伤。线粒体是细胞的“发电厂”，它参与了三羧酸循环和呼吸链的传递。线粒体结构和功能的稳定是细胞维持正常生理功能的前提，线粒体内、外膜之间的通透性转换孔(permeability transition pore,PTP)具有调节线粒体膜通透性的作用。PTP属于Ca2+依赖性电压感受器，正常情况下，绝大多数PTP处于关闭状态。Costantini等[11]发现，百草枯可使PTP电压感受器上的二硫基化合物氧化，诱导PTP大量开放，同时百草枯诱导细胞内Ca2+超载，线粒体膜电位下降，PTP进一步开放，线粒体通透性增大，从而诱导细胞凋亡发生。

1.1死亡受体活化途径 孔庆福等[12]、胡军利等[13]研究发现，百草枯中毒大鼠肺泡巨噬细胞早期产生大量肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)，TNF-α通过与细胞膜上的肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor,TNFR)结合，一方面活化胞内凋亡相关蛋白，激活下游反应，触发细胞凋亡；另一方面激活核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB),NF-κB是一类具有多向性转录调控作用的蛋白因子，正常情况下NF-κB位于细胞胞质内，与核转录因子抑制蛋白(inhibitors of kappa B，IκB)结合，使NF-κB处于无活性状态。当细胞因子(如TNF-α)、氧自由基刺激后，NF-κB与IκB解离，NF-κB进入细胞核，启动下游靶蛋白(包括TNF-α、白细胞介素6、白细胞介素8等)合成，TNF-α合成后反过来进一步激活NF-κB，从而形成恶性循环，导致组织细胞严重损伤[14-15]。

1.2线粒体途径 Takeyama等[16]将表达野生型p53的人肺上皮样细胞系L132与缺乏p53基因的人早幼粒细胞性白血病细胞系U937分别暴露于低浓度的百草枯培养液中培养，发现L132细胞系中p53大量表达，处于S期的细胞百分比明显减少，说明细胞由G1期进入S期受阻；单细胞凝胶电泳显示单链DNA断裂；U937细胞系中DNA虽然受损，但处于S期的细胞百分比几乎无明显变化，显示出对百草枯的抵抗力。该实验说明百草枯可能通过p53蛋白的积累诱导细胞凋亡。Dinis-Oliveira等[17]研究表明，百草枯通过激活多条通路诱导肺组织的细胞凋亡，其中p53、转录激活蛋白呈时间依赖性表达，参与细胞凋亡调控。Yang等[18]将多巴胺能SY5Y细胞经百草枯处理48 h后，测定p53的表达及线粒体内凋亡途径标志物发现，百草枯通过p53参与线粒体内途径诱导人神经母细胞瘤SY5Y细胞凋亡。

Bcl-2蛋白家族成员与细胞凋亡关系密切，包括抗凋亡Bcl-2亚族和促凋亡Bax亚族、BH3亚族等。细胞是否发生凋亡及其严重程度取决于Bcl-2/Bax比值的变化，马玉腾等[19]研究发现，百草枯中毒大鼠肺组织中Bcl-2、Bax蛋白的表达均增高，但Bcl-2增高幅度低于Bax，导致Bcl-2/Bax比值下降，肺组织细胞凋亡增加。Fei等[20]研究发现，百草枯刺激Bcl-2同源拮抗剂(Bcl-2 homologous antagonist/killer，Bak)、BH3结构域凋亡诱导蛋白(BH3 interacting domain protein 3，Bid)、促凋亡调节蛋白BNIP3(Bcl2/adenovirus E1B 19kDa protein interacting protein 3)及Noxa蛋白呈高浓度表达，Bak、BNIP3及Noxa基因沉默可以保护细胞免受百草枯的毒性，该实验证实Bcl-2蛋白家族成员参与百草枯诱导的细胞凋亡的发生。

百草枯可造成线粒体膜电位下降，PTP大量开放，导致细胞凋亡启动因子(如细胞色素C、凋亡酶激活因子、细胞凋亡诱导因子)从线粒体内释放，激活半胱氨酸蛋白酶家族中的胱天蛋白酶(caspase)9和caspase-3，caspase-3是细胞凋亡过程中的关键酶，caspase-3的激活可以看作是细胞凋亡的标志[21]。Caspase-3激活后诱导蛋白质水解，从而诱导细胞凋亡[17]。Rincheval等[22]还发现应用Bcl-2和caspase抑制剂并不能抑制百草枯诱导的细胞凋亡，推断百草枯可能还通过其他途径诱导细胞凋亡。张志坚等[23]通过对百草枯中毒大鼠肾组织中caspase-3表达的研究发现，百草枯染毒组中caspase-3蛋白的表达随时间推移逐渐增多，推测百草枯中毒后肾脏损伤与细胞凋亡有一定的关系。González-Polo等[24]将小脑颗粒细胞置于低浓度百草枯中培养，结果发现线粒体上细胞色素C水平显著减少，而水解蛋白酶和caspase-3活性增加，DNA裂解片段增加，细胞凋亡增强。

与此同时，Mohammadi-Bardbori等[25]发现百草枯的氧化还原反应还可以导致线粒体内膜上的脂质发生过氧化，间接引起细胞凋亡的发生。

1.3内质网应激途径 死亡受体活化以及线粒体损伤途径是细胞内两条经典的凋亡途径，而内质网应激启动的细胞凋亡途径是近10年来新发现的凋亡通路。内质网应激引起的细胞凋亡有其独特的信号转导通路，参与内质网应激的分子伴侣和感受蛋白具有特异性。

Chen等[6]研究发现，百草枯处理24 h后的大鼠肺泡上皮细胞系L2中，细胞生存能力显著下降，内质网应激相关信号因子和蛋白(如糖调节蛋白78、生长停滞及DNA损伤基因)表达水平显著增高，提示内质网应激途径参与了百草枯诱导的肺组织细胞凋亡。该研究同样证实百草枯提高了caspase-3及caspase-7的活性，促进了Bax、Bak、p53蛋白表达，抑制了Bcl-2的基因表达。

综上所述，百草枯可通过死亡受体活化途径、线粒体途径、内质网应激途径诱导肺组织细胞凋亡。

2 百草枯对多型核中性粒细胞的影响

百草枯对多型核中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophils，PMN)是机体抵御外来病原体的第一道屏障，当发生轻微炎性反应时，外周血中的PMN黏附于血管壁并游出至炎症部位，完成吞噬、杀菌作用后即发生凋亡，不引起组织细胞损伤。大量研究发现，当肺组织炎性因子大量释放、Ca2+浓度升高时，PMN凋亡受到抑制，凋亡延迟，导致PMN处于持续激活状态，从而释放大量毒性物质，造成组织细胞损伤[26-27]。

刘建辉等[28]在大鼠腹腔注射百草枯，建立急性肺损伤动物模型，检测肺泡灌洗液中PMN凋亡率，结果发现PMN的凋亡率显著下降，染毒第3日凋亡率最低；应用NF-κB抑制剂(二硫代氨基甲酸吡咯烷)可促进PMN凋亡，推测百草枯通过多条通路诱导NF-κB激活，从而抑制PMN的凋亡，延长PMN的生存时间。除此之外，有学者还认为PMN的凋亡延迟可能与caspase-3和caspase-9的活性降低及线粒体膜电位持续降低有关[29]。

3 百草枯对肺泡巨噬细胞的影响

百草枯对肺泡巨噬细胞所产生的细胞毒性呈时间依赖性，百草枯中毒早期肺泡内大量炎性细胞聚集，以肺泡巨噬细胞为主。肺泡巨噬细胞合成并释放大量细胞因子、前炎性介质、趋化因子以及蛋白水解酶毒性物质，造成急性肺损伤、间质水肿、肺泡内出血，而后肺泡巨噬细胞自身凋亡增加，吞噬能力下降，导致凋亡的中性粒细胞不能及时被清除，产生迟发性坏死，加重炎性反应的发生[30]。

4 小 结

大量研究显示细胞凋亡参与了百草枯所致的急性肺损伤的发生过程，由于肺泡上皮细胞和肺微血管内皮细胞凋亡增加，一方面导致肺泡上皮细胞大量丢失，基膜受损，肺泡表面活性物质减少，肺泡塌陷，肺泡上皮表面的离子转运系统遭到破坏，肺泡间隙水电解质紊乱，微血管通透性增高，引起肺水肿发生；另一方面，有学者认为正是由于肺泡上皮细胞和肺微血管内皮细胞缺失，导致肺间质成纤维细胞代偿性增生，发生过度纤维增殖修复反应，从而造成不可逆的肺纤维化形成。同时，PMN聚集和凋亡延迟进一步加重了肺组织及细胞的损伤。

因此，靶向抑制肺泡上皮细胞及肺微血管内皮细胞凋亡以及促进PMN凋亡可能减轻急性肺损伤，甚至阻止肺纤维化的发生。

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