p53及其相关因子在乳腺癌治疗中的研究进展

蔡绍海，宋 瑾，王 静(综述)，戚晓东(审校)

(北京军区总医院乳腺科，北京 100007)

大量研究表明，癌基因、肿瘤抑制基因(抗癌基因)的异常与乳腺癌的发生、发展密切相关，p53癌基因蛋白是其中判断原发性乳腺癌较好的指标[1-2]。p53癌基因突变在人类肿瘤中最为常见，亦是迄今发现与人类肿瘤相关性最为密切的基因。野生型p53基因在细胞周期中起到“分子警察”的作用，当DNA受到损害时，p53基因作为一种细胞周期调控点，可通过诱导一种暂时性G1停顿而使受损DNA得以修复，或者通过促凋亡作用而消除受损细胞，以确保基因组的完整性，而突变型p53基因不能介导上述任何一种效应，甚至导致肿瘤转移和不良预后[3-4]。目前已知人乳腺癌p53基因突变率为20%，因此成为乳腺癌治疗的重要靶点，药物激活p53成为一种新的肿瘤治疗手段[5-7]。p53并非单独作用，研究发现很多因子可以通过p53影响乳腺癌的发生、发展，如雌激素受体(estrogen receptor,ER)、p53凋亡刺激蛋白(apoptosis stimulating protein of p53,ASPP)、Noxa蛋白、ras基因、人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2，Her-2)等，因此通过研究这些因子可能会找到治疗乳腺癌的新方法。

1 p53相关因子

1.1ER ER定位于第6号染色体长臂，基因长度为140 kb，乳腺癌大多是激素依赖性肿瘤。ER的状态对患者治疗方案及预后判断有重要意义[3,8]。Shirley等[9]发现对乳腺癌密歇根癌症基金会7(Michigan Cancer Foundation-7，MCF-7)细胞系进行阿霉素或电离辐射处理时，在24 h内p53的表达增加了5倍，而ERα表达增加了4倍，利用核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)干扰技术沉默p53基因后，24 h内ERα表达量减少>60%，为了进一步证实p53是否能上调ERα表达，利用瞬时转染把携带有ER近端启动子荧光标记的野生型p53表达载体转染到MCF-7细胞中，观察到ER启动子增加了8倍，同时通过染色质免疫沉淀法证实了p53是通过辅激活因子相关的精氨酸甲基转移酶1、环腺苷酸反应元件结合蛋白、Jun激酶和转录刺激蛋白1等与ER启动子结合而促进ER表达。Liu等[10]应用MCF-7乳腺癌细胞系及RNA干扰技术沉默MCF-7中p53和(或)ERα基因，观察到ERα被沉默后由p53介导的p21转录功能增强，导致细胞凋亡增加，而沉默p53后转录减弱，细胞凋亡减少。Sayeed等[11]也通过对MCF-7细胞系研究发现，沉默ERα基因，p53抑制凋亡抑制基因的转录，从而达到促进细胞凋亡的目的，也证实了ERα与p53结合影响其抑癌功能的机制，这与Fernández-Cuesta等[12]认为ER可对抗p53的促凋亡作用的研究结果一致，同时Konduri等[13]研究证实，他莫昔芬可以破坏ERα-p53的复合体，释放出活性p53，增加细胞凋亡。因此在治疗乳腺癌时，同时考虑ER、p53可能会获得更好的疗效，这也为他莫昔芬与重组p53腺病毒的联合应用提供了理论依据。

1.2ASPP ASPP是Samuels-Lev等[14]在2001年发现的一种新的肿瘤抑制基因家族，包括ASPP1、ASPP2、iASPP等；并且还发现野生型p53乳腺癌中，有60% ASPP1和23% ASPP2的信使RNA表达水平下降，且在这23%的肿瘤中，有90%的ASPP1表达水平下降，同时通过对Jw2、Tero、Saos-2细胞株的研究发现，ASPP2和p53共表达可使50%转染的肿瘤细胞株凋亡，而ASPP2与腺病毒E2启动子活化剂家族1和Bax等肿瘤抑制基因共表达，则不能使细胞凋亡增加[15]。进一步体外实验证明[14]，ASPP2通过增强p53与DNA的结合，促进p53促凋亡基因启动子的活化，增强p53的促细胞凋亡功能。Yang等[16]和Ao等[17]的独立研究均证实，将ASPP2的53BP2片段转染到细胞中能导致细胞凋亡，此外，ASPP2还能够促进p53抑制转染癌基因Ras和E1A的大鼠胚胎纤维母细胞形成结节的能力，同时也增加p53反应基因p21的转录活性，在p53突变的细胞中ASPP2的表达只引起很少一部分细胞发生凋亡，而共表达p53和ASPP2可以引起50%的转染细胞发生凋亡。在正常生长的MCF-7细胞中，有1.5%的p53与ASPP2形成复合体，经过紫外线辐射后，p53和ASPP2形成复合体的数量增加了3.4倍(约5.5%)，提示MCF-7细胞经过紫外线辐射后p53-ASPP2复合体明显增加，并且ASPP2在紫外线辐射后能够明显调节p53促进细胞凋亡的功能。因此，在细胞中ASPP2与p53存在一个平衡状态，在研究针对ASPP2的治疗手段时必须同时考虑p53的影响。ASPP2的措施与p53联合使用，具体方法需要进一步的研究发现和证实。

1.3Noxa蛋白 细胞凋亡主要有两种途径：①由Fas/Fas受体介导的外源性途径；②由Bcl-2家族介导的内源性途径，主要是通过线粒体发挥作用。人Noxa作为Bcl-2家族成员，位于第18号染色体长臂21区，长1954 bp，编码的蛋白Noxa全长为54个氨基酸。Noxa启动子上游含有p53缺氧诱导因子1α、干扰素刺激反应元件、核因子κB和转录因子腺病毒E2启动子活化剂家族1等的结合区，能被它们转录激活[18-21]。Noxa可通过p53依赖途径和p53非依赖途径诱导细胞凋亡，其中p53依赖途径是最主要的。当细胞受到化疗药物及紫外线、神经元细胞的解剖损伤、高半胱氨酸血症和一氧化氮等引起的DNA损伤时，p53可作为转录因子与Noxa启动子中的p53识别结合位点结合，转录激活Noxa来发挥促凋亡作用[ 18-19]。赵志等[22]研究发现，将Noxa转染到MCF-7细胞，结果显示转染有Noxa基因的细胞其增殖抑制和凋亡显著高于空白对照组和阴性对照组，通过对细胞周期的分析发现，转染有Noxa基因表达的细胞DNA合成受到抑制，细胞周期阻滞在G0/G1期。转染外源性Noxa 24 h后细胞即出现周期阻滞和凋亡，48 h达高峰并持续至72 h，提示外源性Noxa基因的高表达对于乳腺癌MCF-7细胞的凋亡具有肯定作用，可能与p53诱导细胞凋亡有关，这与Saha等[23]的研究结果符合。Noxa还可以降低肿瘤细胞的耐药性，并对正常细胞无杀伤作用[20,24]。因此，Noxa为乳腺癌的治疗提供了新的理想途径，针对Noxa甚至Noxa与p53及其相关因子结合治疗乳腺癌需要进一步研究。

1.4ras基因 哺乳动物的ras基因家族有三个成员，分别是H-ras、K-ras、N-ras，表达ras-p21蛋白，这是一种189个氨基酸的蛋白质，属于G蛋白家族[25]。H-ras基因是乳腺癌的主要转化基因之一，在化学致癌物诱发的鼠乳腺癌H-ras突变率高达85%～90%[26]。Ohuchi等[27]研究发现，乳腺从开始增生到逐渐转化为恶性的过程中，p21蛋白水平有增高趋势，从随访15年的18例乳腺增生性病变患者中发现，最终转变为癌的5例标本p21蛋白表达水平显著高于13例无癌变患者，这与姜军等[28]的研究结果一致。Kasid等[29]通过DNA转染技术将C-H-ras基因转入人乳腺癌细胞MCF-7中，也发现激活的ras基因可以使其产生侵袭行为。分子生物学研究证明，p21基因是p53的作用靶点，p53能够结合p21的启动子，诱导p21基因的转录[30]。p53基因的肿瘤抑制作用不是通过p53基因单独完成的，而是由p53、mdm2、mdm4、Bcl-2和p21五个基因所表达的蛋白组成的网络共同调控其抑癌作用的，p53基因是在这个网络中起关键性作用的基因[31]。人多耐药基因1启动子也是ras基因的靶位点，p21与突变型p53协同作用，对其进行特异性正向调节[32]。ras基因的作用为乳腺癌的治疗提供了另一条有效途径，最新研究ras突变的肿瘤中呼肠孤病毒的扩散及促凋亡能力更强，而p53稳定剂也有相同作用[33-35]，说明研究p53及其相关因子联合应用有重要意义。

1.5Her-2 原癌基因Her-2，又称neu，CerbB-2，是位于人染色体17q21上，编码相对分子质量为185×103的跨膜糖蛋白(p185)，目前被认为是与乳腺癌发生、发展密切相关的基因，其产物的过度表达，阳性程度达(++)(+++)，提示恶性度高、预后差，而且15%～20%的肿瘤患者为Her-2阳性，30%的乳腺癌患者存在Her-2的高表达[36-38]。

研究证实，Her-2与p53的表达呈正相关[39]，Her-2/neu能够在没有细胞外配体的情况下发生自身激活，通过磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路，阻止肿瘤坏死因子诱导的细胞凋亡，从而导致恶性肿瘤的发生，且磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路的激活与p53介导的凋亡受阻有关[40-41]。另有研究表明，在人源化的抗Her-2/neu单克隆抗体注射用曲妥珠单抗的作用下，能够提高乳腺癌细胞内p53蛋白的水平[42]。郑莉等[43]的研究也支持这一结论，同时还发现过表达Her-2/neu的MCF-7细胞对γ射线照射的敏感性低于正常的MCF-7细胞,而磷脂酰肌醇3-激酶通路抑制剂LY294002(一种能够阻断三磷酸酰肌醇蛋白激酶细胞信号转导通路的蛋白激酶抑制剂)能在抑制磷脂酰肌醇3-激酶通路的同时，使细胞内p53蛋白水平升高，同时显著提高其对放射治疗的敏感性。Her-2在乳腺癌中的作用巨大，Her-2/neu单克隆抗体注射用曲妥珠单抗研制成功开启了个体化治疗的大门，然而单独应用耐药性及毒性的问题需要慎重考虑，迫切需要找到解决方案[44-46]。因此，联合p53及其相关因子具有广阔前景。

2 p53及其相关因子在乳腺癌治疗中的作用

p53基因自身结构的改变是p53基因抗癌功能丧失的主要机制，对于乳腺癌是一项独立的预后研究因素。鉴于p53基因与乳腺癌的密切关系，已成为人们首先考虑到的基因。p53基因突变或者缺失的肿瘤细胞不能发生细胞凋亡，增加了肿瘤细胞对放射治疗或者化疗药物的耐药性和抵抗性，因此人们尝试使用各种方法重新激活p53[47-49]。外源性引入野生型p53的药物今又生(深圳市赛百诺基因技术有限公司；批准文号：S20040004)的作用也得到实验证实[50]。但是，无论何种药物，单独使用其疗效均不理想，而根据相关因子的作用机制联系，联合用药提高疗效势在必行，如他莫昔芬与Ad-p53联合作用的研究。

3 展 望

乳腺癌的发生率越来越高，与人类生活的关系越来越密切，且发生、发展机制比较复杂，涉及到多种基因的表达异常。p53基因对乳腺癌及其他很多肿瘤的发生、发展、诊断、治疗及预后有重要的价值。随着研究的深入，分子生物学及纳米技术的发展，人们已经开始从分子水平阐述肿瘤的发生机制以及从基因水平上治疗肿瘤，同时p53基因联合其他因子治疗乳腺癌也已经在进行之中，此外，基因治疗与其他治疗手段，如放疗、化疗、内分泌治疗、手术治疗相结合以取得更好的疗效，如何根据患者的个体差异而采取相应的措施，都有待于进一步地研究。

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