苹果病毒病与无病毒苗木建园

姜中武 宋来庆 刘 娟 梁成林 赵建雪 赵玲玲

山东省烟台市农业科学研究院·265500

苹果病毒病是危害苹果树体生长的最主要的病害之一，给果农造成了严重的经济损失。据报道，世界上几乎所有栽培苹果的国家和地区都有病毒的危害。截止目前为止，世界各地已报告的苹果病毒已达有39种之多。根据病毒对苹果的危害特点，通常把苹果病毒分为潜隐性病毒和非潜隐性病毒两大类：①潜隐性病毒。这类病毒一般在苹果的栽培品种上不表现明显的症状。我国分布最广的是苹果褪绿叶斑病毒 (ACLSV)、苹果茎沟病毒(ASGV)和苹果茎痘病毒(ASPV)。我国各苹果产区主要栽培品种的潜隐性病毒的带毒株率在60%～80%。②非潜隐性病毒。这类病毒侵染苹果树后，在大多数品种上都表现明显的症状，根据其症状特点就可进行识别。我国主要有苹果花叶病毒、苹果绿皱果病毒和苹果锈果类病毒。

1 苹果病毒病的种类

1.1 苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）

为纤毛病毒科 （Flexiviridae）发状病毒属（Tricho virus）代表种。可侵染多种仁果类和核果类果树，广泛分布于世界各个果产区。该病毒侵染苹果树一般不产生明显症状，但可与其他病毒复合侵染引起树体衰退。梨树感染该病毒后，在某些敏感的植株上产生褪绿斑或环纹花叶症状。该病毒还可引起核果类果树果实环斑或叶片褪绿斑及裂皮等病害症状。该病毒侵染苹果树后，一般不表明症状，仅可影响产量。

1.2 苹果茎沟病毒（ASGV）

是分布最为广泛的苹果病毒，可侵染多种禾本科植物，在果树上主要通过嫁接和机械途径传播，关于该病毒的自然传播途径尚不清楚。该病毒侵染苹果后一般不表现明显的症状，但是可引起树势生长缓慢，产量降低，品质下降。2年生梨树感染该病毒后，干径生长速度降低63.0%，茎高降低58.0%，枝梢长降低51.0%；梨幼苗干茎降低11.7%，苗高降低13.5%。其生长缓慢主要原因与生长期几种促进生长的内源激素（IAA、GA3、CTK）大幅下降有关。

1.3 苹果茎痘病毒（ASPV）

可侵染多种果树，分布非常广泛。ASPV为潜隐性苹果病毒，在大多数的苹果品种上一般不表现症状，在一些敏感的砧木（virginia Crab）和栽培品种 （Charden和 Reinette Clochard）上症状较明显，主要表现为叶片反卷、木质部茎痘斑、果实凹陷、叶偏上性生长。在梨树上，ASPV能引起梨石痘病(Pear stony pit)、梨脉黄病(Pear vein yellow)等多种病症。

1.4 苹果花叶病毒（APMV)

除苹果和梨外，APMV还有30多种寄主植物，主要为木本植物。APMV侵染苹果后病树叶片出现鲜黄色或黄白色斑，或深绿浅绿相间。按变色斑分布样式，大体有斑驳型、网纹型、花叶型、环斑型、镶边型等几种类型，各种类型的症状可能在同一枝或同一叶片混合出现。可使感病品种的树体生长减少50%，树干直径减少20%，苹果产量减少30%。主要通过嫁接和育苗圃根系嫁接传播。

1.5 苹果锈果类病毒（ASSVd）

可侵染多种核果类和仁果类果树。其发病症状可由于品种和变种不同而不同。ASSVd在一些新品种上的症状主要是果面凹陷不平，而在一些老品种上主要花脸。目前在genebank中登记的苹果ASSVd的变种序列达48条，烟台市农业科学研究院研究表明，在苹果上多为复合侵染，由多条ASSVd变种序列的复合物所侵染。

1.6 苹果凹果类病毒（ADFVd）

该类病毒分布范围比较广，可侵染多种果树。该病毒1996年首次在意大利发现，据报道该病毒侵染的苹果品种主要有红星、嘎拉、粉红女士、布瑞本和富士等。其主要发病症状果实畸形带有绿色的类似凹坑的斑点。

2 苹果病毒病脱毒

2.1 热处理

热处理脱毒技术的原理是根据病毒和寄主植物对高温忍耐程度的差异，在一定的温度下(37～40℃)，病毒被钝化，失去增殖和再感染能力，而寄主植物正常生长。经过一段时间((3～8周)的处理，枝条前端生长点附近不含有病毒颗粒，切除这部分进行人工培养或嫁接到无病毒的砧木上得到无毒的苗木。该技术的关键问题是寄主植物的存活率和脱毒率。处理温度和高温持续时间、处理方式、寄主植物所带病毒种类等对存活率和脱毒率有影响。

2.2 茎尖培养

该技术脱毒的原理是依据在植物体内病毒浓度呈梯度变化，病毒颗粒随植物组织的成熟而增加，旺盛生长的根尖、茎尖很少有病毒分布。茎尖的成活率和脱毒率是茎尖脱毒的两个关键环节。作为脱毒所用的茎尖，一般以带有1～2片叶原基，大小为0.1～0.2 mm为宜，超过0.5 mm时，脱毒效果差。茎尖大小、细胞分裂素浓度、继代次数影响脱毒率。通过茎尖培养脱毒一般有以下几个环节：①材料处理和接种；②诱导芽分化和小植株的增殖，诱导生根；病毒检测；③生根植株的移栽；④移入苗圃。茎尖培养的最大缺点是茎尖不易培养，生根和移栽成活率低。在苹果和草莓上应用二次茎尖脱毒可有效提高脱毒率。

2.3 热处理结合茎尖培养

热处理与茎尖培养结合是现有的效果最好的一种脱毒方法，尤其适用于单独热处理或茎尖培养难以脱除的病毒。该方法首先利用热处理钝化病毒，而后利用热处理过的嫩梢进行茎尖培养，或将试管苗进行热处理，之后再进行茎尖培养，可提高脱毒率30%～40%，所取茎尖大小因植物种类和待脱病毒种类而异，一般为0.5～2.0 mm。

2.4 茎尖微体嫁接

在茎尖培养的基础上，Marashige等提出微体嫁接技术，即将茎尖分生组织嫁接在试管中经脱毒培养的砧木上得到完整的植株。微体嫁接解决了某些木本植物茎尖培养发根困难、生长缓慢的问题，并且可使复合侵染的病毒分离。该技术主要用于核果类果树的脱毒处理。由于有些病毒通过种子或花粉传播，嫁接前应对嫁接砧木进行病毒检测。微嫁接成活率和脱毒率与茎尖大小、病毒种类和接穗来源影响有关。嫁接时茎尖大小一般为0.2～0.3 mm，即带2～3个叶原基，既可除去病毒，又有较高的成活率。

2.5 化学处理

化学处理脱毒的作用机理是利用化学药剂抑制植物病毒的复制来达到脱毒的目的。化学处理往往与组织培养结合进行，即先获得待脱病毒样品的茎尖培养植株，然后在进行离体植株培养的培养基中加入化学抑制物质，继代培养一定时间后，再取新梢在无化学抑制剂的培养基上培养，经病毒检测，保留无病毒的单株。抑制植物病毒活性的化学物质包括代谢拮抗物质、植物生长调节物质等，常用的抗病毒化学药物有三氮唑核苷 (病毒唑)，5-二氢尿嘧啶和双乙酰-二氢-5-氮尿嘧啶。试验证明，12.5 mg/L的抗病毒醚加入培养基80 d (40 d继代1次)，可脱除ASGV和ACLSV，对其它病毒则无效。

2.6 超低温处理

超低温处理是新兴的植物脱毒技术，是以超低温保存和植物组织培养为基础的一种方法。该技术的工作原理是利用液氮超低温（-196℃）对植物细胞的选择性杀伤，得到存活的顶端分生组织。这是由于顶端分生组织具有具有排列紧密、体积小、立方形、核质比高、细胞质浓稠、无成熟液泡的特点，细胞自由水含量低，在超低温环境中细胞质能保持无定形状态或产生不会造成细胞死亡的微小冰粒从而存活。而具有成熟液泡的已分化细胞，由于含有大量自由水在超低温环境中会形成树枝状冰晶，这些冰晶破坏细胞的膜结构，从而导致细胞死亡。超低温脱毒技术包括7个操作步骤，首先以带毒的植物为材料进行组织培养建立试管苗体系，而后利用机械切割的方式获得植物茎尖，对茎尖进行处理以增强其对干燥和超低温的耐受能力，通常是将茎尖培养于含有高浓度蔗糖的培养基上使其脱水，干燥茎尖以增强其对超低温的耐受力如无菌风干燥或玻璃化处理，液氮超低温处理，茎尖复苏及再生，再生植株的继代繁殖及相关检测。该方法采用1.0～1.5 mm的茎尖为试材，降低了试验操作难度，具有操作简便、实验周期短、脱毒效率高等优点。缺点是种间差异大，不同品种需要分别建立脱毒技术体系，而且超低温处理后茎尖存活率较低。

3 苹果病毒病检测

苹果病毒病的检测目前所采用的技术包括指示植物法、血清学检测技术、分子生物学技术和电镜技术。

3.1 指示植物法

该方法主要是通过不同的病毒在不同或相同的寄主植物上产生不同的症状来进行的。以对某种病毒十分敏感的植物作为指示物，将脱毒处理后获得的植株，嫁接在指示植物上，根据病毒侵染指示植物后的症状，对病毒的存在与否及种类做出鉴别。常用的病毒指示植物主要有黎科、茄科、豆科、葫芦科等植物。该方法缺点是特异性较差，灵敏度也较低，往往存在一病多症、多病一症的现象。检测速度慢，受季节限制，获得检测结果所需时间长，该方法一般需要 1～2年。

3.2 血清学检测法

目前最常用的血清学方法是酶联免疫吸附法 (Enzyme Linked ImmunosorbentAssay,ELISA)。ELISA是将抗原和抗体的免疫反应与酶的高效催化反应相结合而应用于植物病毒检测的方法。其原理是通过化学的方法，将酶与抗体或抗原结合起来，形成酶标记物，具有活性的酶标记物与相应的抗原或抗体反应，形成更大的复合体，加入酶反应底物呈颜色反应，从而达到检测病毒的目的。ELISA法检测病毒具有成本低，适于测定大量样品，灵敏度较高，可检测ng(10-9g)水平的病毒，操作简单，不需要使用同位素和复杂的设备，且对人体基本无害等一系列优点。但是，此法检测需制备高质量的抗血清，免疫反应物消耗量较大，抗体(或抗原)被酶联板吸附后与抗原(或抗体)的结合力下降，抗原与抗体结合比在液相中慢。而且有的病毒在某些情况下缺乏外壳蛋白，如类病毒则没有外壳蛋白；受病毒系统和复合侵染的木本植物，钝化病毒和制备抗血清难于完成；寄主植物中低浓度的病毒无法检测。检测时有假阳性反应，需要设置各种对照。

3.3 分子生物学检测

分子生物学方法是通过检测病毒核酸来证实病毒的存在，该技术比ELISA灵敏度高、特异性强、快速，可用于大量样品的检测，并且适应范围广，其应用的对象为RNA病毒、DNA病毒及类病毒。目前常用的分子生物学技术包括核酸分子杂交技术、双链RNA电泳技术、RTPCR技术。

3.3.1 分子杂交技术 利用互补的核苷酸序列通过碱基配对形成稳定的杂合双链分子的过程来进行的，检测对象是基因组DNA或总RNA。该方法特异性强，灵敏度高，可检测到lpg的植物病毒基因组DNA，但存在同位素标记有放射性污染，cDNA探针半衰期短的缺点。

3.3.2 双链RNA电泳技术 其原理是ssRNA病毒在植物体内增殖，通过核酸互补而形成一种健康植物没有的碱基配对dsRNA。dsRNA经提纯、电泳、染色后，在凝胶上所显示的谱带可以反映每种病毒组群的特异性，并且有些单个病毒的dsRNA在电泳图谱上也显示一定的特征。因此，利用病毒dsRNA的电泳图谱可以检测出病毒的类型和种类。已知和未知的病毒及低浓度的病毒，具有快速、灵敏、简便等优点。但钝化dsRNA比较麻烦，不能检测小于ng级水平及大规模样品。

3.3.3 RT-PCR技术 是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法，是目前应用最为广泛的果树病毒检测技术。该技术克服了上述两种技术的缺点，可检测fg（10-15g）浓度的植物病毒及大规模的样品。近年来发展了复合RT-PCR是在同一RT-PCR反应体系中用几对不同的引物同时检测多个目的片段。 应用复合RTPCR和用单一RT-PCR做相同数目的病毒检测相比，节约了时间和试剂。PCR技术用于植物病毒的检测具有特异性强、灵敏度高、快速简便又无放射性的危害。近来，又衍生出一些以PCR技术为基础的病毒检测方法，如RT-PCR法、IC-PCR法、IC-RT-PCR法、PCR微量板杂交法，套式PCR等。在RT-PCR基础上又发展了IC-RT-PCR和多重IC-RT-PCR。与RTPCR相比，IC-RT-PCR技术可使灵敏度提高1250倍，多重IC-RT-PCR可以准确的同时检测出两种以上症状相似、难以区分的病毒。

3.4 电镜技术

电子显微镜以电磁波为光源，利用短波电子流，分辨率可达到0.1 nm，而病毒粒体大小为10～100 nm，采用电镜观察有无病毒存在。利用该方法应该首先对不同病毒组的形态和典型病毒的特点有所了解，将病毒粒体经过提纯，用超速离心机反复低温离心，将病毒粒子提纯分离出来。而后用提纯液进行电镜制片，观察病毒形态结构。由于电子穿透能力低，样品必须很薄，制样需选取病毒浓度最高的组织。

4 已获的脱毒苹果品种

由于苹果病毒病是一种系统性疾病，到目前为止，尚没有有效的防治方法，培育无病毒苗木是唯一有效的途径。我国苹果无病毒苹果的培育始于上世纪90年代，经过20多年的研究，利用不同的脱毒方法，目前已获得30多个苹果脱毒品种和砧木。这些品种主要包括烟台市农科院果树所培育的烟富3号、青岛农业科学研究所董淑英获得的长富1、早生乔纳金，甘肃农业大学吴玉霞获得的华红、红将军等12个品种，粉红佳人、烟富1号，以及河北农业大学晏娜利用化学处理和热处理获得了王林、乔纳金、嘎拉、金冠、珠美海棠、天红1号、M9等22个品种（砧木）。

5 脱毒苗木建园

5.1 脱毒苗木园地选择

脱毒苗木植株长势健壮，和常规苗木相比，其株行距应略大，平原地、土壤肥沃的土地，行距最少为5.0 m，可选用3.0 m×5.0～6.0 m的宽行密植建园模式。建园时应配置适当的授粉树。

5.2 栽植时采用行间起垄栽培模式，行间种植黑麦草和鼠茅草或自然生草

秋施基肥一般每667 m2施3000～5000 kg有机肥，混施100 kg氮、磷、钾复合肥；生长季土壤含水量应稳定在田间最大持水量的60%～80%；有条件的果园可安装喷滴灌或水肥一体化设施，提高肥水利用效率。幼树期，前期以氮肥为主，后期以磷、钾肥为主，尤其是在8月份后应严格控制氮肥的投入。相同管理条件下，脱毒苗长势强劲，苗木增长快，后期果园氮肥充裕易出现停长期而不能及时停长的现象，冬季易发生冻害。

5.3 脱毒苹果品种长势健壮，对枝干轮纹病等病害的抗性较强，生产上应按照常规苹果苗木管理方式做好病虫害的防治

秋季果树落叶后，进行树干涂白，防止冬季冻害和幼树抽条。