基于全基因组克隆分析乙型肝炎病毒变异株的结构和功能

2014-03-06 17:49付亚辉综述刘洪波审校

医学综述 2014年23期

付亚辉(综述)，刘洪波(审校)

(1.大悟县中医院检验科，湖北大悟 432800; 2. 桂林医学院附属医院检验科，广西桂林 541001)

全球约有3.5亿乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)慢性感染者，其中25%的感染者将发展成为肝硬化和肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)[1]。乙型肝炎疫苗的接种使中国人群的乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)携带率从10%降到7.18%[2]，但仍然有近1.2亿HBsAg携带者，他们存在发展为慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)、肝硬化和HCC的风险。

HBV基因组为带有单链缺口的双链DNA，含有4个开放读框，分别编码包膜蛋白、核心蛋白、多聚酶蛋白和X蛋白。病毒通过RNA中间体进行复制。宿主的免疫反应缺陷被认为是引起HBV持续感染和HCC的主要原因[3]。HBV毒株对于乙型肝炎的临床转归以及流行病学意义也有一定的作用。HBV不能在传统的细胞培养系统中繁殖，且HBV只能感染黑猩猩和人类，因而很难研究来自患者和无症状携带者(asymptomatic carriers，ASC)HBV株的生物学功能。自Günther等[4]将来自于患者的HBV株的全长基因组克隆转染细胞并成功进行体外培养后，以含1.2～1.3拷贝HBV基因组的重组质粒转染细胞进行培养已被广泛用于HBV变异株生物学特征的研究。该综述基于该方法对不同来源的HBV变异株的结构和功能属性进行总结。

1 来自乙型肝炎疫苗接种失败者HBV株的研究

HBsAg是乙型肝炎疫苗的唯一组分，在暴露前接种具有预防作用，母婴传播暴露后接种也具有免疫保护作用。HBsAg中124～147位密码子被认为是S蛋白的中和表位(即a决定簇)，其突变可导致与对应抗体结合效率降低，从而产生免疫逃逸，使突变株在人群中传播[5-6]。因此，在世界范围内对常见突变体的监测可作为预测现行乙型肝炎疫苗预防效率的一个重要手段，监测结果也可为新一代乙型肝炎疫苗的研发提供提示。

除了各种S突变体降低了与抗HBs的结合效率，129L突变体(540位核苷酸A→T)虽然具有正常的结合抗HBs的能力，但其降低了免疫原性[7]。以突变的a决定簇替代野生型a决定簇的1.2拷贝长度的HBV重组质粒来研究突变株抗原性和免疫原性间的分离。同野生型病毒相比，129L突变株表达的HBsAg对24种针对a决定簇的单抗中的大多数具有更高的结合效率，但以129L突变的DNA免疫小鼠所产生的抗HBs滴度显著降低，认为129L突变所致的免疫原性降低与谷氨酸转变为亮氨酸后疏水性增加有关。相比起来，从谷氨酸到组氨酸转变的突变株129H并未显示出这种独特的生物学特征[8]。既然129L突变株不能诱导有效的免疫反应，那么129L突变株感染可能导致持续性感染。

2 来自急重型乙型肝炎患者HBV突变株的研究

尽管很少发生急重型乙型肝炎(fulminant hepatitis B，FHB)，但在HBV呈地方性流行的地区，FHB的高致死率已成为一个重要问题。HBV感染的重症化过程通常被归因于异常的宿主反应[3]，但越来越多的证据显示，HBV某些基因型和特定的变异株与FHB的发病密切相关，在日本、中国以及印度的FHB患者中常见的HBV为B1、C2和D1亚型，而且来自不同地区，分属不同基因亚型的HBV变异株可能存在相同的突变，如A1762T/G1764A基本核心启动子(basal core promoter，BCP)突变和G1896A前C基因终止密码子突变等[9-12]。Hayashi等[13]认为，B4/Ba亚型的BCP/前核突变体可能与FHB的进展相关。Wu等[12]的研究发现，来自重型乙型肝炎和其他患者的毒株基因组的多个突变的突变频率存在着显著差异，认为这种高频突变或复杂突变的累积和持续与HBV感染的进展及疾病恶化有关。目前的研究发现，核心蛋白[9,11]、多聚酶[9]和前Bagaglio[14]等其他区域的变异株也与FHB的发生相关。

变异株相对于野生株有更高的复制效率，其被认为是发展为FHB的重要原因[10,15]。Inoue等[15]在对一起重型乙型肝炎暴发的病例监测中发现，1例死亡患者的HBV DNA水平高达1.1×1011拷贝/mL，且存在前C基因A1896突变、BCP区T1762/A1764双突变等，因此认为重症感染的发展与快速复制的HBV突变株可能存在关联。Sugauchi等[10]将来自重型乙型肝炎患者的Bj亚型前C启动子A1896突变克隆与来自新发乙型肝炎患者的Bj亚型和C亚型野生型克隆转染Huh7细胞，以DNA印迹检测复制子发现，突变克隆单链带的密度显著高于后两者，认为A1896突变使Bj亚型复制能力提高是导致FHB的可能原因。然而也有研究发现，FHB与CHB患者HBV的基因型及基因组变异的分布相似[16]。因此，对于高复制能力和某些特定变异株是导致FHB的重要原因仍存在争议。对于FHB的发生是否可能存在其他致病因素？以不同复制效率的HBV分离株DNA免疫小鼠，结果显示，FHB分离株免疫组与ASC分离株免疫组之间的抗HBc水平相似；前者的抗HBs更高，高水平的抗HBs滴度不仅存在于FHB的高复制毒株，也存在于FHB的低复制毒株；FHB组与ASC组的HBV分离株免疫鼠脾细胞，并经HBsAg诱导后产生的干扰素γ水平也无显著差异。结果提示，FHB的发生可能是病毒株的生物学特征与宿主免疫反应的共同结果[7]。

3 来自HCC患者全长HBV基因组的研究

HBV的慢性感染是HCC最重要的危险因素，某些特定基因型(如C基因型)或基因突变(特别是前C基因突变和BCP区突变)预示有更高的恶化风险[17]。通过全长HBV基因组分析可探究HCC患者与非HCC患者的HBV分离株是否存在核苷酸序列差异；通过进一步的细胞转染可揭示这些特定HBV分离株是否存在功能上的差异。

Takahashi等[18]报道，40例日本HCC患者血清中HBV分离株大多为C基因型，并存在BCP 和1762T/1764A的双突变。其他多个国家或地区的横向病例对照或队列随访研究发现，T1762/A1764双突变是CHB发展为HCC的独立危险因素[19-21]。然而，Fan等[22]在比较38例CHB和34例HCC患者的HBV基因型和X区基因时发现，两组患者的T1762/A1764双突变并无显著差异，C基因型和更高病毒负荷有更高的T1762/A1764双突变发生率。该研究采用横断面研究，且样本量相对较小，未排除或校正如基因型等混杂因素，因此并不能完全否定BCP双突变在HCC发展中的作用。HBV的高效复制可增加病毒变异的概率，HBV DNA的高水平也预示着HCC的高风险[23]。变异也可以影响病毒载量，HBV突变和持续复制可能是HCC发展的独立危险因素，其可通过相互影响大大提高患HCC的风险。Lin等[24]研究1例患者从ASC发展为HCC 4年间11个HBV分离株的全长基因组发现，发展为HCC前后的所有分离株并无单一共同突变；通过细胞转染，HCC后的分离株比HCC前的分离株有更强的复制能力。分子流行病学研究比较了中国和塞内加尔的ASC的HBV DNA持续时间发现，中国的ASC在感染30年后HBV DNA仍然存在，而塞内加尔的ASC在感染30年后其HBeAg转为阴性；而相比塞内加尔，中国的HBV慢性感染者有更高的HCC发生率[25]。另一方面，干扰素治疗可以降低HBV相关肝癌的转移和复发也反证了这样一个观点，即HBV复制能力可能同HCC的进展相关[26]。复制能力更高的变异体显然在面对药物或宿主免疫攻击时有着更高的突变发生率，而经过选择的突变逃逸株其复制能力的提高可能刺激机体更强的免疫病理反应。

为了探讨HBV复制循环中产生的剪接缺陷型基因组的功能，将来自HCC患者的HBV双剪接变异体与对应的全长基因组共转染HepG2细胞，结果发现，该剪接体在HBV X表达框完好的情况下可增强全长病毒的复制能力[27]。Kaur等[28]在分析HCC不同阶段肝组织标本中HBV的甲基化水平时发现，HCC和肝硬化患者HBV基因组甲基化水平较阴性CHB患者组织中更高，在体外以HBV感染肝细胞也获得了相似的甲基化模式。该研究提示，HBV基因组的超甲基化与组织恶化过程高度相关。对HBV基因组结构以及分离株的功能性分析有助于了解HBV和HCC之间的相关性，但是对这些变化，如HBV基因组甲基化的生物学本义及其在HCC中的作用仍需进一步的研究。

4 HBV耐药突变株的研究

长期的核苷类似物治疗常导致HBV耐药株的出现，使治疗失败[3]。将HBV全长基因组克隆后转染细胞进行体外培养，可以监测分离株的药物抵抗性或对新药物的敏感性[29]，也可研究耐药突变体的功能性变化。Warner等[30]培养阿德福韦耐药突变体(rtA181T/sW172)时发现，突变体不仅本身存在分泌缺陷，而且对野生型HBV病毒体的分泌有负作用；复制效率降低的阿德福韦耐药突变体再发生前C或BCP区突变后，尽管HBeAg未能表达，但其复制能力可恢复到野生型水平[31]。因此，仅依据病毒载量判断药物治疗是否失败可能导致错误判断。

5 结语

将来自于不同患者的HBV全长基因组和剪接变异体克隆转染细胞并进行研究，可揭示不同HBV分离株变异所导致的复制能力、病毒蛋白的表达及属性变化；结合动物实验和流行病学研究，可以进一步证实HBV分离株的的进化所导致的免疫性和致病性改变。因此，利用HBV全基因组克隆的体外培养方法，对HBV的临床分离株进行持续监测，可为病毒因素在HBV相关性疾病的致病机制中所扮演角色的最终揭开提供重要线索。

[1] WHO.State of the world′s vaccines and immunization.Global Programme for Vaccines and Immunization(Third Edition)[EB/OL].http://whqlibdoc.who.int/publications/2009/9789241563864_eng.pdf

[2] Lu FM,Zhuang H.Management of hepatitis B in China[J].Chin Med J(Engl),2009,122(1):3-4.

[3] Milich DR.Immune response and viral hepatitis B[M]//Shih CH.Chronic hepatitis B and C:basic science to clinical applications.Singapore:World Scientific Publishing Co.Pte.Ltd.,2013: 35-70.

[4] Günther S,Li BC,Miska S,etal.A novel method for efficient amplification of whole hepatitis B virus genomes permits rapid functional analysis and reveals deletion mutants in immunosuppressed patients[J].J Virol,1995,69(9):5437-5444.

[5] Velu V,Saravanan S,Nandakumar S,etal.Transmission of "a" determinant variants of hepatitis B virus in immunized babies born to HBsAg carrier mothers [J].Jpn J Infect Dis,2008,61(1):73-76.

[6] Larralde O,Dow B,Jarvis L,etal.Hepatitis B escape mutants in Scottish blood donors [J].Med Microbiol Immunol,2013,202(3):207-214.

[7] Wen YM,Wang YX.Biological features of hepatitis B virus isolates from patients based on full-length genomic analysis[J].Rev Med Virol,2009,19(1):57-64.

[8] Wu L,Yuan ZH,Liu F,etal.Comparing the immunogenicity of hepatitis B virus S gene variants by DNA immunization[J].Viral Immunol,2001,14(4):359-367.

[9] Khare S,Negi SS,Singh S,etal.Genetic analysis of precore/core and partial pol genes in an unprecedented outbreak of fulminant hepatitis B in India[J].Epidemiol Infect,2012,140(10):1823-1829.

[10] Sugauchi F,Tanaka Y,Kusumoto S,etal.Virological and clinical characteristics on reactivation of occult hepatitis B in patients with hematological malignancy[J].J Med Virol,2011,83(3):412-418.

[11] Inoue J,Ueno Y,Kawamura K,etal.Association between S21 substitution in the core protein of hepatitis B virus and fulminant hepatitis[J].J Clin Virol,2012,55(2):147-152.

[12] Wu W,Chen Y,Ruan B,etal.Gene heterogeneity of hepatitis B virus isolates from patients with severe hepatitis B[J].Hepatobiliary Pancreat Dis Int,2005,4(4):530-534.

[13] Hayashi K,Katano Y,Chuong TX,etal.Prevalence of hepatitis B virus subgenotypes and basal core promoter,precore variants in patients with acute hepatitis B in central Vietnam[J].Intervirology, 2009,52(1):22-28.

[14] Bagaglio S,Albarello L,Biswas P,etal.Virological pattern of hepatitis B infection in an HIV-positive man with fatal fulminant hepatitis B:a case report [J].J Med Case Rep,2009,3:110.

[15] Inoue K,Ogawa O,Yamada M,etal.Possible association of vigorous hepatitis B virus replication with the development of fulminant hepatitis [J].J Gastroenterol,2006,41(4):383-387.

[16] Sterneck M,Günther S,Gerlach J,etal.Hepatitis B virus sequence changes evolving in liver transplant recipients with fulminant hepatitis [J].J Hepatol,1997,26(4):754-764.

[17] Pujol FH,Navas MC,Hainaut P,etal.Worldwide genetic diversity of HBV genotypes and risk of hepatocellular carcinoma[J].Cancer Lett,2009,286(1):80-88.

[18] Takahashi K,Akahane Y,Hino K,etal.Hepatitis B virus genomic sequence in the circulation of hepatocellular carcinoma patients:comparative analysis of 40 full-length isolates[J].Arch Virol,1998,143(12):2313-2326.

[19] Li W,Chen G,Yu X,etal.Accumulation of the mutations in basal core promoter of hepatitis B virus subgenotype C1 increase the risk of hepatocellular carcinoma in Southern China[J].Int J Clin Exp Pathol,2013,6(6):1076-1085.

[20] Lyu H,Lee D,Chung YH,etal.Synergistic effects of A1896,T1653 and T1762/A1764 mutations in genotype c2 hepatitis B virus on development of hepatocellular carcinoma[J].J Viral Hepat,2013,20(3):219-224.

[21] Asim M,Malik A,Sarma MP,etal.Hepatitis B virus BCP,Precore/core,X gene mutations/genotypes and the risk of hepatocellular carcinoma in India [J].J Med Virol,2010,82(7):1115-1125.

[22] Fan W,Shi B,Wei H,etal.Comparison of hepatitis B X gene mutation between patients with hepatocellular carcinoma and patients with chronic hepatitis B [J].Virus Genes,2011,42(2):162-170.

[23] Chen CF,Lee WC,Yang HI,etal.Changes in serum levels of HBV DNA and alanine aminotransferase determine risk for hepatocellular carcinoma [J].Gastroenterology,2011,141(4):1240-1248.

[24] Lin X,Qian GS,Lu PX,etal.Full-length genomic analysis of hepatitis B virus isolates in a patient progressing from hepatitis to hepatocellular carcinoma [J].J Med Virol,2001,64(4):299-304.

[25] Evans AA,O′Connell AP,Pugh JC,etal.Geographic variation in viral load among hepatitis B carriers with differing risks of hepatocellular carcinoma[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,1998,7(7):559-565.

[26] Chen LP,Zhao J,Du Y,etal.Antiviral treatment to prevent chronic hepatitis B or C-related hepatocellular carcinoma[J].World J Virol,2012,1(6):174-183.

[27] Ma ZM,Lin X,Wang YX,etal.A double-spliced defective hepatitis B virus genome derived from hepatocellular carcinoma tissue enhanced replication of full-length virus[J].J Med Virol,2009,81(2):230-237.

[28] Kaur P,Paliwal A,Durantel D,etal.DNA methylation of hepatitis B virus (HBV) genome associated with the development of hepatocellular carcinoma and occult HBV infection[J].J Infect Dis,2010,202(5):700-704.

[29] Lada O,Benhamou Y,Cahour A,etal.In vitro susceptibility of lamivudine-resistant hepatitis B virus to adefovir and tenofovir[J].Antivir Ther,2004,9(3):353-363.

[30] Warner N,Locarnini S.The antiviral drug selected hepatitis B virus rtA181T/sW172* mutant has a dominant negative secretion defect and alters the typical profile of viral rebound[J].Hepatology,2008,48(1):88-98.