朱艳艳(综述),张怀勤,周 浩(审校)
(温州医学院附属第一医院心内科,浙江 温州 325000)
松弛素是1926年Hisaw[1]在研究妊娠期间骨盆带变化时发现的肽类激素之一,主要由卵巢和妊娠时的胎盘以及雄性动物的前列腺产生,具有松弛盆腔韧带、扩张子宫颈、抑制子宫收缩等作用,故命名为松弛素。松弛素在细胞分化、增殖、胶原沉积、降解、炎性细胞浸润、凋亡发生、扩张血管、调节体液平衡等过程中发挥重要的作用。近年来发现,松弛素与多种疾病相关,如癌症、心血管疾病、纤维化疾病等[2]。
纤维化是指组织内实质细胞减少、纤维结缔组织增多的过程。细胞外基质过度合成和降解减少是其主要机制,其中胶原蛋白是其主要成分。过度组织重构和纤维化最终将导致器官功能衰竭。研究证明,心脏和肾脏是松弛素的来源和靶器官[3]。另外,松弛素成功改善了各种动物模型的心脏和肾脏纤维化。因此,松弛素有望用于治疗心肾纤维化疾病,并应用于临床。
松弛素由两条链组成,包括22个氨基酸残基组成的A链和35个氨基酸残基组成的B链,链内链间以二硫键相连接。编码松弛素多肽的基因有三种,分别为H1、H2、H3。H1和H2位于第9号染色体(9p24),H3基因位于第19号染色体(19p13.3)。其中H2编码的松弛素是组织储存以及血液循环中存在的主要形式。其B链正中区域为受体结合区,含有2个精氨酸残基(精氨酸B13和精氨酸B17),能与松弛素家族肽类受体RXFP1结合并在每个精氨酸侧脸产生氢键网。第三个氨基酸异亮氨酸残基B20是至关重要的RXFP1结合位点,与RXFP1结合,产生三角形的“RXXXRXXI”接触区域-结合盒。这个结合盒中的残基证明为RXFP1的胞外结构域。A链N端形成α螺旋,是没有功能的。缩短A链N端的氨基酸残基对结合RXFP1和RXFP2并没有影响。H2的活性核心是H2(A4-24)(B7-27)[4]。
体内有多种细胞可分泌松弛素,主要为黄体,其次为蜕膜、胎盘、子宫内膜、卵泡内膜细胞、卵泡颗粒细胞及乳腺组织。雄性动物的松弛素主要来源于前列腺。啮齿类动物的大脑、胸腺、心脏和肾脏等部位可表达松弛素[5]。有报道称,在大鼠心房有高亲和力松弛素结合位点[3],小鼠肾皮质存在松弛素受体表型[6],人类的心脏也可检测到松弛素基因转录的痕迹以及松弛素结合位点[7-8]。以上研究表明,心脏和肾脏是潜在的松弛素来源和靶器官。
松弛素受体为富含五个平面折叠的多个亮氨酸序列(leurine rich repears,LRRs)的鸟嘌呤核苷酸结合G蛋白偶联受体,LGR7、LGR8、GPCR135、CPCR142为RXFP1~4。其中RXFP1和RXFP2是主要受体,都包含低密度脂蛋白α、LRRs、跨膜域的外侧襻。LRRs是松弛素与其受体的高亲和力结合位点。松弛素与LRRs区结合改变RXFP1的外侧区域的构象,进而促使低密度脂蛋白α与G蛋白偶联并活化腺苷酸环化酶。H2与RXFP1和RXFP2都可以结合,但H3只能作用于RXFP1[5]。
目前研究发现,松弛素的信号转导涉及多条通路,如环腺苷酸信号途径,促分裂原活化的蛋白激酶信号[9],一氧化氮信号途径[9-10],基质金属蛋白酶(matrix matalloproteinase,MMP)信号[11-12],糖皮质激素受体途径[13]。其中与纤维化调节相关的主要是cAMP信号、一氧化氮信号和MMP信号。
3.1cAMP信号 可通过Gi和Go偶联调节cAMP/蛋白激酶A通路:松弛素激活后可结合G蛋白偶联受体激活GS(G蛋白分为Gs、Gi、Gq和G124大类)蛋白,激活胞外信号调节激酶,而刺激一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)使一氧化氮的产生增加。在大鼠心房,Gi/Go抑制剂可抑制松弛素诱导cAMP[9]。另外,还可通过酪氨酸受体防止cAMP积累。
3.2一氧化氮信号 松弛素可通过Gβγ亚基和3-磷酸肌醇通路直接激活内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS),通过cAMP通道激活蛋白激酶A从而活化IκB,因此通过炎性细胞因子核因子κB增加诱导型一氧化氮合酶的表达,抑制心室肥大纤维化作用。松弛素还可通过与RXFP结合,引起血管内皮的MMP的活性增加, MMP-2和MMP-9可以水解大内皮素的甘氨酸亮氨酸键产生内皮素1-32,而内皮素1-32又可以增强内皮细胞内皮素B受体-一氧化氮舒张血管通路[10]。
3.3MMP信号 松弛素通过与RXFP结合,引起血管内皮的MMP活性增加,MMP可促进胶原降解,MMP-1(胶原酶)切割3/4和1/4胶原片段,MMP-3和MMP-10能作用于蛋白多糖、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白、Ⅲ型和Ⅳ型胶原及明胶。MMP-7能作用于明胶和纤维粘连蛋白,MMP-9可作用于明胶。因此,MMP和金属蛋白酶组织抑制剂的比例降低可能影响心室重构[12]。MMP-2可切割Ⅰ型胶原蛋白,以及纤维连接蛋白和非纤维状胶原蛋白[11]。
成纤维细胞具有快速增殖、生成大量纤维连接蛋白和各种胶原(尤其是胶原Ⅰ和Ⅲ)的能力,故长期以来认为其在纤维化的发生和发展中起重要作用。成纤维细胞有四个来源:固有的组织成纤维细胞或血管周围和血管外膜的成纤维细胞,骨组织迁移的骨髓源性纤维细胞,上皮细胞间质转化和内皮细胞间质转化(endothelium-mesenchymal transformation,EndMT)。其中后两者在纤维化组织中成为成纤维细胞的重要来源。上皮细胞间质转化是指上皮细胞松动细胞与细胞间的黏附结构,包括黏附路口和桥粒,调节其极性,重新安排细胞骨架中间丝切换细胞角蛋白至波形蛋白,在心肌纤维化中主要是指心外膜源性细胞的上皮细胞间质转化作用[14]。EndMT是指内皮细胞改变其极性、形状并迁移到周围组织,伴随着内皮细胞标志的丧失,如CD31,血管内皮细胞-钙黏蛋白,并表达间质细胞标志,如α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、波形蛋白、前胶原Ⅰ和成纤维细胞特定蛋白1[15]。
Goumans等[16]首次在纤维化的心脏中发现EndMT,并有相关实验证明了EndoMT由转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)信号介导。2007年,Zeisberg等[15]研究证明了EndoMT在三个慢性纤维化肾脏疾病小鼠模型中(单侧输尿管梗阻性肾病、链脲霉素诱导的糖尿病肾病、Alport肾脏疾病)可促进积累激活成纤维细胞和肌纤维母细胞,且TGF-β通路抑制剂和SIS3(Smad3抑制剂)可阻断EndoMT的作用,减少肾脏纤维化,延缓肾病进展。另有研究显示,TGF-β可通过其受体(活化素受体样激酶4,5,7)导致Smad2和Smad3的磷酸化,并诱导EndoMT 至心肾纤维化[17]。
松弛素对胶原纤维的合成和降解都有明显的影响:一方面松弛素可通过抑制由血管紧张素Ⅱ或TGF-β刺激的胶原合成,胶原沉积,成纤维细胞分化,抑制α-SMA刺激的成纤维细胞活化,抑制血管紧张素Ⅱ和胰岛素样生长因子1刺激的成纤维细胞的增殖[11,18];另一方面它能够提高MMP的表达,并抑制金属蛋白酶组织抑制因子的表达,增强胶原纤维降解[9]。TGF-β是一个促纤维化的细胞因子,在纤维化中起着重要的作用,而松弛素抑制TGF-β已得到充分的证实[11,19-20]。
松弛素在各器官纤维化中均可发挥一定的抗纤维化作用,尤其是心脏和肾脏。研究发现,松弛素基因剔除(松弛素-/-雄性小鼠可出现年龄相关性多器官纤维化,包括心脏和肾脏[3]。12个月雄性松弛素-/-小鼠左心室胶原含量和浓度以及肾脏胶原浓度较野生型高。对心肾纤维化的12个月大的松弛素-/-小鼠输注2周重组H2松弛素,成功降低了胶原沉积。可见松弛素是极为重要的抗心肾纤维化因子。在自发性高血压大鼠模型中,松弛素可显著降低左心室胶原、肾的胶原蛋白含量,且增加MMP-2水平,说明松弛素可同时改善心脏和肾脏的纤维化[21]。
5.1松弛素抗心肌纤维化 在心肌组织中松弛素可通过RXFP1-eNOS-环鸟苷酸干扰TGF-β1/Smad2通路抑制EndMT的发生。松弛素可通过Gβγ亚基和磷脂酰肌醇激酶通路直接激活eNOS并催化生成一氧化氮[9]。长期以NOS抑制剂左旋硝基精氨酸甲基酯阻断一氧化氮的大鼠可导致TGF-β1上调以及心脏纤维化和重构[22-23]。Leask[24]注意到通过eNOS的传递增加一氧化氮的表达可显著减少心肌梗死后大鼠的心肌纤维化,且与对照组相比TGF-β的血浆水平较低。以上研究表明,在心肌组织中松弛素可通过一氧化氮途径干扰TGF-β1/Smad2通路抑制EndMT发生。
松弛素对抗心肌纤维化作用在各个疾病模型研究中已经得到充分的证实。持续滴注松弛素 2周或松弛素基因由病毒结构传递,在心肌病、高血压、异丙肾上腺素引起的心脏毒性、糖尿病心肌病和心肌梗死模型中可持续抑制或逆转心脏纤维化[25]。在心肌细胞过度表达β2肾上腺素受体的模型中,基质重构和纤维化构成心肌病表型的早期病理过程,静脉推注腺病毒介导的松弛素基因(Ad-Rln),2周内可观察到有效的逆转心肌纤维化[3,18]。H3松弛素也可以减弱异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌纤维化作用。新近研究发现,在小鼠心肌梗死后松弛素治疗可以明显减少梗死区和交界区胶原纤维的致密度,而对左心室功能和左心室重构并无不利影响[26]。可见,松弛素只对抗患病的心肌纤维化,而并不影响未受影响的心肌区域的基础胶原表达,提示松弛素是一个安全且有效的抗纤维化的激素[27]。
5.2松弛素抗肾脏纤维化机制 在肾脏,松弛素通过RXFP1-神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)-一氧化氮-环鸟苷酸依赖途径抑制TGF-β1/Smad2信号介导的EndMT。松弛素结合RXFP1刺激cAMP短暂升高,通过Gαs和GαoB蛋白增加胞外信号调节激酶1/2的磷酸化,激活nNOS-一氧化氮-环鸟苷酸依赖通路,抑制Smad2磷酸化抑制TGF-β1信号。nNOS、一氧化氮和环鸟苷酸抑制剂可阻断松弛素对α-SMA和Smad磷酸化的抑制作用,而左旋硝基精氨酸甲基酯可显著阻断松弛素在体内对胶原的抑制作用[5]。松弛素通过抑制Smad2、Smad3磷酸化以及其与Smad4复合物从细胞质转移至细胞核,反过来抑制Smad2、Smad3配合物形成,使其与TGF-β信号失去联系从而抑制TGF-β诱导肌成纤维细胞分化,胶原合成,而对Smad3、Smad4、Smad7磷酸化或易位或调节c-Jun NH2-终端酶1/2,细胞外信号相关蛋白激酶或p38丝裂原活化蛋白激酶则无影响[3,6]。上述研究结果表明,松弛素可抑制病变部位的TGF-β1介导的肌纤维母细胞分化,胶原过表达,而不影响基础表达,在健康部位可预防异常纤维化。
松弛素对抗肾脏纤维化的作用在各个肾脏疾病模型研究中也已得到充分的证实。在单侧输尿管梗阻大小鼠模型中,单侧输尿管结扎术后胶原、α-SMA表达显著升高,单侧输尿管结扎术前4 d给予重组H2松弛素预处理可改善术后4 d总胶原、Ⅳ型胶原并抑制TGF-β2生成和细胞增殖;在单侧输尿管结扎手术后第10日,松弛素 mRNA表达下降了80%[28]。可见松弛素可作为肾小管间质纤维化的一个调节因子,是肾脏疾病进展的标志。溴乙胺模型研究发现,可引起严重的肾间质纤维化,肾小球滤过率下降,蛋白尿形成,而松弛素治疗组溴乙胺大鼠血清肌酐水平正常,白蛋白排泄率略下降,且在皮髓交界区,间质纤维化显著下降,也平行减少了TGF-β1的免疫反应,巨噬细胞浸润和保护肾小球滤过率[19]。在抗肾小球基膜肾炎模型中,松弛素可降低血清肌酐、尿蛋白,降低肾小球硬化和间质纤维化[20]。以上肾脏疾病模型实验充分证明了松弛素是一种有效的抗肾脏纤维化因子。
目前从不同的方面证实了松弛素具有抑制心、肾纤维化的作用,同时重组人松弛素也已经过了Ⅰ期[22]、Ⅱ期[29]、Ⅲ期[30]临床试验,且得到了良好的效果,因此重组人松弛素有望成为临床治疗心、肾纤维化的重要药物。有报道称,松弛素可作为男性终末期肾病的死亡风险因子,男性终末期肾病患者所有死亡风险与松弛素水平呈线性关系,松弛素每增加5 ng/L可增加心血管的死亡风险[30],可见松弛素不仅可作为治疗药物,而且可作为评估心肾疾病预后的指标。但目前研究成果有限,仍需不断探索,继续研究。
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