急性白血病遗传学改变的预后分析及微小残留病检测

刘以俊，周婧倩，王慧莹，金卢阳，孙 婧(综述)，何颖芝，李玉华※(审校)

(1.南方医科大学第二临床医学院，广州 510282； 2.南方医科大学珠江医院血液科，广州 510282)

随着化疗方案的改进和造血干细胞移植的进展，急性白血病(acute leukemia,AL)的完全缓解率得到明显提高，然而仍有许多获得完全缓解的患者在数年内复发。5年总体生存率仅为40%～50%[1]。白血病微小残留病(minimal residual disease,MRD)是复发的主要原因。监测MRD为预测复发的重要途径。目前监测MRD的方法主要有形态学、细胞遗传学、荧光原位杂交、流式细胞技术和定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)。定量PCR目前应用较为广泛。其靶基因有融合基因、突变基因和异常表达基因。随着临床实验室检测的进展，不断有新的异常表达基因被发现，如表皮生长因子受体通路底物8(epidermal growth factor receptor pathway substrate 8，Eps8)，热门的异常表达基因，如WT1(Wilms′s tumor-1 gene)又有许多新进展。该文所选取的WT1、尾型同源盒基因(caudal-type homeoboxgene,CDX)2和Eps8基因均可能有提示预后和监测复发的作用。

1 WT1基因

1.1WT1基因的结构与功能 WT1基因是从肾胚胎肿瘤中分离得到的抑癌基因，位于染色体11p13上。WT1蛋白有4个锌指结构，分别是Cys2-His2。同时，还含有富含脯氨酸(Pro)和谷氨酸酰胺(Gln)的区域，主要用于调节转录[2]。WT1基因主要表达于胚胎期，并且对泌尿系统的发育起重要作用。成年以后，WT1基因仅少量表达于肾脏、口腔、子宫内膜、睾丸、脾脏和正常造血干细胞[3]。

1.2WT1基因的临床意义

1.2.1WT1基因的表达变化 WT1基因在骨髓细胞中极少量表达，在外周血细胞中几乎不表达。大多数AL细胞中有WT1基因的高表达。但是，在WT1基因的表达与白血病诊断的亚型是否有关仍存在争议。Schmid等[4]通过RT-PCR对125例急性髓系白血病(acute myelocytic leukemia,AML)患者的骨髓标本进行了检测，结果显示，WT1基因在73%的患者中高表达。但是，诊断时的WT1基因高表达与患者的年龄、FAB(French-American-British)分型和染色体组形态等因素无关。Shimada等[5]对158例儿童AML患者进行了WT1 mRNA的定量分析显示，初诊的骨髓标本77.8%为WT1阳性，其中存在inv(16),t(15;17)和唐氏综合征时WT1基因高表达，存在11q23染色体畸形时WT1基因低表达。

1.2.2WT1基因与AL的预后 尽管WT1基因在AL患者中高表达得到了专家的认可，但对其与AL预后的关系仍有争议[4-5]。Polak等[6]用实时荧光定量PCR检测了51例AML患者的外周血标本，结果显示，异基因造血干细胞移植前WT1基因高表达的患者预后更差，且检测外周血WT1含量有助于监测MRD。Pozzi等[7]研究122例AML患者发现，67例(55%)患者有WT1基因的高表达，即高于100拷贝，并且WT1高表达较WT1低表达患者的复发率更高，5年生存率更低。Pozzi等[7]对17例WT1表达过高的患者进行了供者淋巴细胞输注，这些患者的生存率为44%，而没有接受该治疗的21例WT1高表达患者的生存率仅为14%。据此，研究者认为WT1可用于提示AL患者的预后。Andersson等[8]发现，骨髓标本或外周血标本的WT1基因转录产物在1个月内降低一个数量级以上的患者，其复发率较低，生存率较高，因此研究者认为WT1基因有望成为成人AML的MRD监测靶点。

也有专家质疑WT1基因对白血病预后的提示作用。Schmid等[4]通过RT-PCR的方法分析了125例AML的初诊患者，结果显示，WT1基因不能预测完全缓解率、缓解持续时间和生存率，认为其治疗方案的不统一可能是导致阴性结果的原因之一。同时指出WT1基因对于MRD的预测作用还有待进一步研究。有报道称，WT1基因在诊断时没有提示预后的价值，但在化疗结束后的M1亚型或有FLT3-ITD(FLT3-internal tandem duplication,FLT3-ITD)基因突变的AML中有此作用[5]。

对于WT1基因能否作为监测MRD的靶点，人们一直存在争论。有部分学者认同这一观点[6,8-9]。Polák等[10]通过荧光定量PCR检测了51例AML患者外周血的WT1基因，同时还用细胞形态学、流式细胞技术和检测融合基因等方式监测MRD，结果表明，检测外周血WT1含量有助于监测MRD，并且7例患者的WT1基因比其他监测MRD的方法更加敏感。Polák 等[10]通过实时荧光定量PCR检测151例AML患者后得出了相同的结论，同时还确定出AML缓解的WT1基因上限为0.02 WT1/ABL。据此上限，可以预测或早期诊断AML的复发。但是，也有研究结果与此相反[11-12]。Elmaagacli等[11]用PCR分析了46例AL的患者，认为WT1不能作为异基因造血干细胞移植后监测MRD的靶点，MRD只能用于预测有t(15；17)异位的AML患者。Luna等[12]用高分辨溶解和荧光能量共振转移杂交探针来检测175例成年AML患者的WT1基因单核苷酸多态性rs16754，得出WT1同样不能作为MRD靶点的结论。

2 CDX2基因

2.1CDX2基因、蛋白的结构与功能 编码同源盒转录因子，可分为GSH(Glutathione Synthetase)2、CDX1、CDX2、CDX3和CDX4基因，有调节胚胎造血的功能[14]。CDX2基因位于人类染色体的13q12～12区，包含3个外显子和2个内含子，CDX2蛋白对胚胎发育和成人肠上皮细胞的增殖和分化起着重要作用[15]。研究显示，鼠骨髓祖细胞中CDX2的高表达会干扰淋巴细胞的生成[16]。同时，急性淋巴细胞白血病(acute lmphocytic leukemia,ALL)白血病细胞中CDX2的减少会抑制ALL前B细胞株Nalm-6集落的形成。

2.2CDX2基因的临床意义

2.2.1CDX2基因与白血病发病 有t(12;13)(p13;q12)的AML同时表达了CDX2 基因和融合基因ETV6(ets variant 6)-CDX2。Rawat等[17]发现，只有当移植含有CDX2基因的白血病细胞后才能使小鼠患病。由此推测，异位表达的CDX2基因是导致AML的重要因素。有报道显示，阻断CDX2蛋白的N端可扰乱同源异型基因(homeotic genes,Hox)的表达，从而诱发白血病。针对151例AML患者的研究得出，环加氧酶的含量和Hox有相关性[18]。有报道显示，CDX2基因在90%的AML患者中高表达，但在正常人的造血干细胞和祖细胞中低表达[15,18]。

2.2.2CDX2基因与白血病预后 Thoene等[16]发现，ALL中有CDX2的高表达，以ph(+)ALL、B-ALL和前T-ALL最明显。CDX2水平与生存率呈负相关，并且CDX2的高表达可以作为ALL的一个危险因素。Lu等[18]用实时荧光定量PCR分析了108例AML患者和7名志愿者的CDX2基因表达情况，认为CDX2的高表达预示较低的完全缓解率。

Riedt等[19]用流式细胞技术和实时荧光定量PCR检测了37例儿童ALL患者的CDX2转录产物，并将其与常规方法得出的MRD结果进行比较，发现CDX2/胆色素原脱氨酶>4%的患者更容易在开始化疗33 d和完全缓解2周后出现MRD阳性。

3 Eps8基因

3.1Eps8基因、蛋白的结构与功能 Eps8基因全长169 436 bp，mRNA长为4088 bp，定位于人类染色体12p12.3。Eps8蛋白是表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)的底物之一，为一种相对分子质量为(68～97)×103的酪氨酸激酶。Eps8蛋白在细胞的运动、有丝分裂和骨架形成中起重要作用[19-20]。Eps8蛋白可分为三个区域，N末端的磷酸化酪氨酸结合区，中心的SH3(Src Homology 3 domain)区域，C末端的效应区域。SH3区域有连接的作用，有助于形成Eps8-Abil(E3bl)-Sos1复合物。C末端效应器可以激活Sos1(Ras和Rac蛋白的双重鸟嘌呤核苷酸交换因子)[22]。

3.2Eps8基因的临床意义

3.2.1Eps8基因在恶性肿瘤中的表达变化 在多个研究中，Eps8基因被证明在垂体瘤、子宫颈癌、口腔鳞状细胞癌、结肠癌、胰腺癌和乳腺癌等实体瘤中高表达，而且Eps8多与癌细胞的增殖、入侵和转移有关，有望成为白血病的治疗靶点和监测预后的指标[23-28]。最近研究显示，血液学恶性肿瘤中也有Eps8基因的异常表达。熊文艳等[28]用实时荧光定量RT-PCR和Western-blot分析了KGla(人髓系白血病细胞株)、HL-60(人早幼粒细胞性白血病细胞株)、K562(人慢性髓系白血病、红白血病变细胞株)、ARH-77(多发性骨髓瘤细胞株)、RPMI-8226(人多发性骨髓瘤细胞株)和Raji(人Burkitt′s淋巴瘤细胞株)的mRNA和蛋白质水平，结果显示，上述细胞株中只有ARH-77有Eps8 mRNA的高表达，只有ARH-77和KG1a有Eps8蛋白的高表达。

3.2.2Eps8基因与白血病预后 在宫颈癌、甲状腺癌和乳腺癌等实体瘤中，Eps8基因高表达预示肿瘤耐药和预后不良[27-29]。在恶性血液肿瘤中，Eps8也有可能成为监测预后的新靶点。Kang等[30]对97例儿童ALL患者的外周血和骨髓白细胞进行了基因表达谱的分析，统计分析显示，除了年龄因素，FMS样酪氨酸激酶3、易洛魁族同源盒2和转化酸性卷曲含蛋白2对无事件生存率的影响较大，这三种基因与Eps8有关。研究发现，FMS样酪氨酸激酶3低表达的一组中预后良好，而余下的儿童按表达率不同的易洛魁族同源盒2和转化酸性卷含蛋白2分成了两组，两组间的生存率有明显差异，在此分类中，易洛魁族同源盒2、Eps8及三唑磷水解酶基因52表达提示儿童ALL预后不良。南方医科大学珠江医院血液科实验室正在研究Eps8在白血病中的MRD监测作用以及进行相关疫苗的研发。

4 小 结

目前，AL的完全缓解率已经有较大提高，但复发仍是影响患者长期生存率的主要因素，因此监测MRD有重大意义。随着对WT1、CDX2和Eps8基因研究的不断深入，它们对恶性血液肿瘤预后的提示作用逐渐得到学者的认可，同时也有越来越多的学者探寻其对MRD的监测意义，但仍缺乏大样本的随机对照临床研究。目前临床采用的融合基因和突变基因的表达率和代表性都难以满足需求。该文所述的基因有可能成为更加实时准确的MRD监测靶点。

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