肝素类药物防治阿尔采末病的研究进展

郝丽娜，赵孝林，吴学新

（山东大学齐鲁儿童医院药学部，山东济南250022）

肝素类药物防治阿尔采末病的研究进展

郝丽娜，赵孝林，吴学新

（山东大学齐鲁儿童医院药学部，山东济南250022）

本文分析了阿尔采末病（AD）的病理机制，对肝素类药物神经保护机制的进展进行了综述。阐明了肝素类药物可通过调节IP3受体介导的细胞内钙释放，影响淀粉样蛋白（Aβ）沉积及其毒性、调节tau蛋白的磷酸化状态，保护胆碱能神经元等发挥神经保护作用，从而延缓AD的发生与发展。

肝素；阿尔采末病（AD）；细胞内钙；淀粉样蛋白；tau蛋白；胆碱能神经元

阿尔采末病（Alzheimer′s disease，AD）是一种以进行性认知功能障碍和记忆力损害为主的中枢神经系统退行性疾病，是老年性痴呆最主要的类型。其典型的病理改变是在特定脑区出现选择性的神经元和突触丢失，淀粉样蛋白（amyloid－β，Aβ）沉积形成的胞外老年斑（senile plaques，SP）和磷酸化的tau蛋白组成的细胞内神经元纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFTs）的形成［1］。AD的发病机制复杂，20世纪80年代以来形成各种假说，但是对本病的病因和发病机制一直未完全明了，目前还缺乏特效的治疗药物。因此，开发新型有效的抗AD药物具有重要的理论意义和广阔的临床应用价值。

1 肝素类药物概述

肝素（heparin）是存在于体内的生物活性物质，1916年由McLean从肝脏中发现而得名。肝素是糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）家族中的成员之一，由重复的二糖单位组成，平均分子量范围在12～14 kDa，附着于细胞膜和细胞外基质（extracellular matrix，ECM））。肝素在沿血管的肥大细胞颗粒中含量丰富，黏膜组织中也存在。当机体发生损伤时，肝素从这些颗粒中释放入血液中从而发挥抗凝作用。近年来对肝素的研究已经扩大到非抗凝的范围，包括抗炎、抗肿瘤、抗增殖、抗哮喘等作用［2］，肝素首次用于AD治疗是源于它能通过抗血栓作用改善大脑微循环这一假设。但因其不能通过血脑屏障（blood－brain barrier，BBB）和进入细胞内，以及引起血小板减少和出血倾向等不良反应，阻碍了它在神经系统的应用。

低分子量肝素（low molecular weight heparin，LMWH）是由未分级肝素经化学或酶解方法降解而成的低分子量的片段，平均分子量约为5 kDa［3］。与肝素相比，低分子量肝素具有分子小、出血副作用少及良好的药代动力学等特点［4］，在临床上得到广泛应用，目前上市的有达肝素钠、依诺肝素、舍托肝素和亭扎肝素等。

超低分子量肝素（ultra low molecular weight heparin，ULMWH）由未分级肝素经进一步降解而成，其平均分子量为（2.0±0.2）kDa。由于其分子量较小，可能通过血脑屏障并在脑脊液（cerebro－spinal fluid，CSF）中分布［5］。而且，超分子量肝素保留了抗凝血酶（antithrombin，AT）活性位点的五糖结构而显示出更好的疗效和安全性［6］。本文现就肝素类药物防治阿尔采默病作用的基础性研究进展作一综述。

2 肝素类药物与阿尔采末病

2.1 肝素类药物与细胞内钙 Ca2＋是一种参与细胞内和细胞外很多过程的关键性离子，钙信号已被证实可以调控各种细胞功能，包括基因表达，细胞生长、分化、自由基的形成和细胞死亡。在大脑中，神经细胞内生理浓度的Ca2＋是维持其生理功能所必需的，可以调节神经细胞的生理活动，包括膜兴奋性、神经质合成、传递和释放，突触可塑性和学习记忆。而细胞内Ca2＋浓度的持续升高则会导致细胞凋亡、变形和坏死［7］。越来越多的证据表明，神经细胞内钙稳态失衡（Calcium dysregulation）在AD的发病机制中起着核心作用，即所谓的“钙超载学说”。

Németh等［2］发现，肝素能剂量依赖性地抑制Hela细胞中由组胺诱导的钙动员，阻止细胞外钙内流触发的内钙释放，抑制RBL－2H3细胞中毒胡萝卜素诱发的钙库耗竭。肝素也可作用于非容量性钙通道（non－capacitive Ca2＋channel），防止自发性的钙内流。此外，肝素能明显地延迟经Triton－100处理后的细胞钙离子以及其它二价阳离子的内流时间，但不减少这些阳离子的数量，说明肝素并不简单地起阳离子螯合剂的作用，而可能是通过钙库操纵性钙通道（store operated Ca2＋channels，SOCC）调节了容量性的钙内流。

值得注意的是，肝素是一个明确的IP3受体的拮抗剂，早在1988年Ghosh等［8］就发现肝素可以竞争性地拮抗IP3所介导的细胞内钙释放，其主要原因在于肝素的一个或多个带负电荷的N－端硫酸化氨基己糖残基结构与IP3受体存在相似性，能够直接与IP3结合位点交互作用，阻碍了IP3与受体结合，从而抑制了Ca2＋释放。但由于肝素分子量较大不能透过细胞膜，因此在研究各种信号通路时，需采用显微注射的方法将肝素直接注射到细胞内。Jonas等［9］将LMWH注入体外小脑切片的蒲肯野（Purkinje）细胞中发现，LMWH可通过阻断IP3受体从而抑制谷氨酸诱导的细胞内钙释放，从而对细胞产生保护作用。最新的实验研究发现，ULMWH可通过升高Bcl－2表达，降低Caspase－3表达抑制Aβ25－35所诱导的神经元凋亡。而且，ULMWH还可以在亚细胞水平上显著降低 IP3诱导的 Ca2＋从内质网和线粒体释放［10，11］。

另外，在平面脂双层实验中发现，肝素还能调节细胞内另一种钙通道受体—兰尼丁受体［12］（ryandodine receptor），但在细胞水平尚未被证实。

2.2 肝素类药物与β淀粉样蛋白（Aβ） Aβ是由正常存在于细胞膜上的淀粉样前蛋白（amyloid precursor protein，APP）通过相应的分泌酶水解而成的纤维丝样蛋白，由39～43个氨基酸残基组成，分子量约为4 kDa。APP在体内有两种代谢途径［13］：①非淀粉源途径：在α－分泌酶（α－secretase）作用下，APP第16位氨基酸残基处发生裂解产生较大的N端片段sAPPa和小的跨膜片段（C83），sAPPa具有神经营养和神经保护作用；②淀粉源途径：APP在β分泌酶（β－secretase，又称β－site amyloid cleavage enzyme 1，BACE1）作用下于氨基端裂解，产生大的N端片段（sAPPβ）和一跨膜片段（C99），sAPPβ的40或42位点经γ分泌酶（γ－secretase）的作用水解形成Aβ1－40和Aβ1－42。Aβ1－42主要在受累患者的大脑组织中沉积，而Aβ1－40则主要集中在脑脊液。正常生理条件下，Aβ是微量、可溶性的，它的产生、降解和清除是一个动态平衡过程。但在AD患者脑内这种平衡被破坏，脑内微环境改变，Aβ通过与周围因素相互作用，其羧基端自聚形成核因子，以核因子为核心的β－折叠，形成透明状的β－原纤维，再经过连续的β－折叠，最终形成β－纤维丝。富含β－折叠结构的疏水区暴露，从而使Aβ聚集，进而沉积生成老年斑。Aβ的沉积可以激活一系列病理事件，包括星型胶质细胞和小胶质细胞的激活、血脑屏障的破环和微循环的变化等，是AD患者脑内老年斑周边神经元变性和死亡的主要原因［14］。许多研究表明，肝素类药物可以通过影响上述不同环节防止或延缓AD的进程。

2.2.1 抑制淀粉样前蛋白（APP）的生成和分泌 Leveugle等［15］发现，不同分子量的肝素对APP的合成和分泌的作用完全不同，在神经母细胞瘤细胞中，全长的肝素可以刺激APP的合成和分泌；低分子量肝素对APP的分泌无显著作用，但其片段尤其是肝素二糖可有效地抑制肝素对APP分泌的刺激作用，并阻止肝素与Aβ1－28的结合。而且，他们在体外模型中也进一步证实了低分子量肝素可以通过血脑屏障。

2.2.2 抑制β－纤维丝形成和沉积 给小鼠注射相当于临床用量的依诺肝素和达肝素钠，能使炎症相关（inflammation－associated，AA）的淀粉样蛋白沉积减少。体外分析表明，这些低分子量肝素可以通过抑制纤维形成必需的构象改变，从而阻止AA和Aβ肽纤维的生成［16］。Snow等［17］将Aβ与硫酸肝素一起注射到大鼠海马区，结果表明Aβ不能形成纤维丝而沉积。

2.2.3 降低Aβ诱导的神经毒性及炎症反应 体外实验证明，肝素能剂量依赖性的降低Aβ1－42诱导的神经毒性，减少补体系统和解除系统的活性，补体系统和接触系统是AD患者脑中炎症反应的两个主要效应因子，提示肝素能降低前炎症反应（pro－inflammatory）活性［18］。采用依诺肝素治疗过表达APP的转基因小鼠，腹腔给药，每周3次，每次6IU，6个月后可显著降低皮层β淀粉样沉积的数量和面积，以及整个皮层Aβ1－40的浓度。通过对神经胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）酶联免疫分析，依诺肝素可显著降低β淀粉样沉积包绕的星型胶质细胞的数量。体外细胞实验表明，依诺肝素也可以剂量依赖性地降低Aβ对神经细胞的毒性作用，抑制补体系统和接触系统的激活［19］。

2.3 肝素类药物与tau蛋白 微管是重要的细胞骨架成分，与有丝分裂、细胞内转运等多种功能有关，微管由管蛋白（tubylin）和微管相关蛋白（tau蛋白含量最高）组成［20］。正常脑中tau蛋白能与成熟神经元的微管结合，促进微管形成，维持微管稳定性，降低微管蛋白分子的解离，并诱导微管成束。在正常成年人脑中，由于tau蛋白mRNA剪接方式不同，可产生6种同功异构体，由同一基因编码，并受磷酸化、糖基化、泛素化等修饰。其中，tau蛋白磷酸化对其与微管的结合至关重要，正常情况下每分子tau蛋白有2～3个磷酸基，而AD患者脑中tau蛋白的磷酸化水平是正常人的3倍，每分子tau蛋白可含5～9个磷酸基。tau蛋白的超磷酸化可使其丧失生物学功能，导致其分子的聚集，形成配对螺旋样纤维（pairedhelical filaments，PHF），进一步聚集可形成神经纤维缠结（NFT），且NFTs的数量与患者的痴呆程度呈正相关。Tau蛋白的这种变化可使微管结构崩解，进而使神经元发生退变。因此，tau蛋白的过度磷酸化被认为是AD的关键致病因素，抑制tau蛋白的过度磷酸化也成为AD治疗的研究方向之一。那么，针对tau蛋白有两种治疗方法：抑制tau蛋白磷酸化或促进其脱磷酸化［21］。

tau蛋白的磷酸化和脱磷酸化水平主要受体内的蛋白激酶（protein kinase）和磷蛋白磷酸酶（phosphoprotein phosphatase，PP）调节，目前已知的调节tau蛋白磷酸化的酶有神经元cdc 2类激酶（neuronal cdc2－likekinase，NCLK），调节tau蛋白脱磷酸化的蛋白磷酸酶主要有三种：PP1，PP2A和PP2B，其中以PP2A和PP2B的作用最为突出。

Walzer等［22］采用杏仁核注射Aβ25－35（被认为是Aβ发挥毒性作用的片段）建立了模仿AD病理学的动物模型，发现低分子量肝素（舍托肝素和C6）能明显减少tau蛋白的异常磷酸化和星型胶质细胞增多，而且这种作用与给药时间以及分子量的大小密切相关，但并不影响Aβ的聚集状态。低分子量肝素的这种保护作用需要一个长期的治疗过程，推测可能通过成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factors，FGF）发挥作用。

Dudas等［23］建立了海马注射Aβ25－35大鼠模型，采用口服给予超低分子量肝素C3（25mg·kg－1，一日1次），于造模前3 d前给药，连续口服17 d，或者皮下给予C3（2.5 mg·kg－1，一日两次），连续注射36 d，结果表明C3可以显著地降低Aβ所诱导的大鼠脑内海马区域tau－2的免疫反应活性，促进神经元轴突和树突生长。

2.4 肝素类药物与胆碱能神经元 1982年，Bartus等提出了胆碱能假说，认为学习和记忆能力的丧失与前脑基底核和海马区胆碱能神经功能的下降有着密切的联系。对AD患者的病理研究显示，其基底前脑胆碱能神经元明显丢失，胆碱能神经纤维退变，患者脑脊液和脑组织中乙酰胆碱转移酶（choline acetyltransferase，ChAT）和乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE）的活性明显下降，乙酰胆碱的合成、释放、摄取等功能亦明显下降。胆碱能神经元发生损害后可能会引起突触减少甚至丧失，进而引起认知、记忆等多方面的功能障碍。脑内胆碱能神经系统的退变被认为是造成AD的最重要病理因素之一。

Rose等［24］采用大鼠双侧脑室内注射AF64A建立了胆碱能损伤模型，并于造模前7 d口服给予C3（25 mg·kg－1，一日1次），继续口服7 d。研究发现，C3能减少AF64A所诱导的大鼠大脑隔膜和扣带回中胆碱能神经元损伤。定量的神经元计数显示，C3能使中隔膜的神经元丢失降低60%。酶分析显示，C3还能明显恢复显著恢复AF64A所诱导的ChAT和AChE活性降低，提示C3能保护大脑内的胆碱能神经元，但是最佳给药剂量和最优的给药时间尚未可知。

进一步实验显示，口服给予5、10 mg·kg－1的C3，连续给药14 d，或者给予25mg·kg－1的C3，仅造模前口服7 d或造模后口服7 d，均不会产生显著作用，这说明C3能时间依赖性和剂量依赖性地降低AF64A诱导的胆碱能损伤［25］。这种时间依赖性也提示C3发挥作用可能是一个神经保护和修复的过程，其机制可能是通过调节NGF释放和／或NGF受体的表达［26］。

3 结语

综上所述，对神经退行性疾病的研究表明，肝素类药物可以通过抑制IP3受体介导的细胞内钙释放，抑制APP生成和分泌，Aβ沉积以及Aβ所引起的毒性，调节tau蛋白的磷酸化状态以及保护脑内的胆碱能神经细胞等来发挥其神经细胞保护作用，从而对抗AD所引起的一系列病理状态。低分子量肝素和超低分子量肝素分子量小，易通过血脑屏障和透过细胞膜，加之副作用小等特点，更具备开发成治疗AD新型药物的前景。

［1］Mattson MP.Pathways towards and away from Alzheimer′s disease［J］.Nature，2004，430（7000）：631－639.

［2］Németh K，Kurucz I.Suppression of Ca2＋influx by unfractionated heparin in non－excitable intactcells viamultiple mechanisms［J］.Biochem Pharmacol，2005，69（6）：929－940.

［3］Zhou X，Li L，Linhardt RJ，et al.Neutralizing the anticoagulant activity of ultra－low－molecular－weight heparins using N－acetylglucosamine 6－sulfatase［J］.FEBS J，2013，280（10）：2523－2532.

［4］Ma Q，Cornelli U，Hanin I，et al.Heparin oligosaccharides as potential therapeutic agents in senile dementia［J］.Curr Pharm Des，2007，13（15）：1607－1616.

［5］Ma Q，Dudas B，Hejna M，et al.The blood－brain barrier accessibility of a heparin－derived oligosaccharides C3［J］.Thromb Res，2002，105（5）：447－453.

［6］Lima MA，Viskov C，Herman F，et al.Ultra－low－molecular－weight heparins：precise structural features impacting specific anticoagulant activities［J］.Thromb Haemost，2013，109（3）：471－478.

［7］Yu JT，Chang RC，Tan L.Calcium dysregulation in Alzheimer′s disease：from mechanisms to therapeutic opportunities［J］.Prog Neurobiol，2009，89（3）：240－255.

［8］Ghosh TK，Eis PS，Mullaney JM，et al.Competitive，reversible，and potent antagonism of inositol 1.4.5－triphosphate－activated calcium release by heparin［J］.J Biol Chem，1988，263（23）：11075－11079.

［9］Jonas S，Sugimori M，Llinas R.Is low molecular weight heparin a neuroprotectant？［J］.Ann N Y Acad Sci，1997，825（1）：389－393.

［10］Hao LN，Zhang QZ，Yu TG，et al.Antagonistic effects of ultra－low－molecular－weight heparin on Aβ25－35 induced apoptosis in cultured rat cortical neurons［J］.Brain Res，2011，1368：1－10.

［11］Hao LN，Zhang QZ，Yu TG，et al.Modulation of ultra low molecular weight heparin on［Ca2＋］in nervous cells［J］.Brain Res Bull，2011，86（5－6）：355－359.

［12］Bezprozvanny IB，Ondrias K，Kaftan E，et al.Activation of the calcium release channel（ryandodine receptor）by heparin and other polyanions is calcium dependent［J］.Mol Biol Cell，1993，4（3）：347－352.

［13］Selkoe D J.Alzheimer′s disease：genes，proteins，and therapy［J］.Physiol Rev，2001，81（2）：741－66.

［14］郝丽娜，张庆柱，于天贵.非甾体类抗炎药抗阿尔采末病作用的研究进展［J］.中国药理学通报，2008，24（8）：988－992.

［15］Leveugle B，Ding W，Laurence F，et al.Heparin oligosaccharides that pass the blood－brain barrier inhibitβ－Amyloid precursor protein secretion and heparin binding toβ－Amyloid peptide［J］.JNeurochem，1998，70（2）：736－744.

［16］Zhu H，Yu J，Kindy MS.Inhibition of amyloidosis using low－molecular－weight heparins［J］.Mol Med，2001，7（8）：517－522.

［17］Snow A D，Sekiguchi R，Nochlin D，et al.An important role of heparin sulfateproteoglycan（Perlecan）in amodel system for the deposition and persistence of fibrillar beta－amyloid in rat brain［J］.Neuron，1994，12（1）：219～234.

［18］Bergamaschini L，Donarini C，Rossi E，et al.Heparin attenuates cytotoxic and inflammatory activity of Alzheimer amyloid－beta in vitro［J］.Neurobiol Aging，2002，23（4）：531－536.

［19］Bergamaschini L，Rossi E，Storini C，et al.Peripheral treatmentwith enoxaparin，a low molecular weight heparin，reduces plaques and－amyloid accumulation in a mouse model of Alzheimer′s disease［J］.J Neurosci，2004，24（17）：4181－4186.

［20］张均田.老年痴呆的发病机理和治疗策略［J］.药学学报，2000，35（8）：635－640.

［21］Lin，XQ，Zhang QZ.The Drug Development Based on Pathogenetic Research in Alzheimer′s Disease［J］.Advances in Alzheimer′s Disease，2014，3（2）：55－63.

［22］Walzer M，Lorens S，Hejna M，et al.Low molecular weigh tglycosaminoglycan blockade ofβ－amyloid induced neuropathology［J］.Eur J Pharmacol，2002，445（3）：211－220.

［23］Dudas B，Cornelli U，Lee JM，et al.Oral and subcutaneous administration of glycosaminoglycan C3 attenuates Aβ（25－35）－induced abnormal tau protein immunoreacitvity in rat brain［J］.Neurobiol Aging，2002，23（1）：97－104.

［24］Rose M，Dudas B，CornelliU，etal.Protective effectof the heparin－derived oligosaccharide C3，on AF64A－induced cholinergic lesion in rats［J］.Neurobiol Aging，2003，24（3）：481－490.

［25］Rose M，Dudas B，Cornelli U，et al.Glycosaminoglycan C3 protects against AF64A－induced cholinotoxicity in a dose－dependent and time－dependent manner［J］.Brain Res，2004，1005（1－2）：96－102.

［26］Rose M，Cornelli U，Hanin I.Low molecular weight glycosaminoglycan C3 attenuates AF64A－stimulated，low－affinity nerve growth factor receptor－immunoreactive axonal varicosities in the rat septum［J］.Brain Res，2005，1033（91）：34－40.

Research progress on the effects of heparins on Alzheimer′s disease

HAO Li-na，ZHAO Xiao-lin，WU Xue-xin
（Department of Pharmay，Qilu Children′s Hospital of Shandong University，Jinan 250022，China）

This paper analyzed the pathologicalmechanisms of AD，reviewed the progress of themechanisms of the neuroprotective effect of heparin and its derivatives，clarified thatheparin and its derivatives had neuroprotective effects through regulating IP3Rs－mediated intracellular calcium release，inhibiting Aβdeposition and Aβ－induced toxicity，regulating the tau protein phosphorylation state，and protecting cholinergic neurons，thereby delayed the occurrence and development of AD.

Heparin；Alzheimer′s disease；Intracellular calcium；Aβ（β－amyloid peptide）；Tau protein；Cholinergic neurons

R749

A

2095－5375（2014）11－0657－004

郝丽娜，女，博士研究生，主管药师，研究方向：神经药理学，E－mail：haolina1984＠163.com