小分子干扰RNA非病毒纳米载体的设计进展

郑荣

上海市普陀区妇婴保健院，上海 200062

将与内源性m RNA序列相对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(doub lestranded RNA，dsRNA)导入细胞，可使内源性m RNA降解和基因沉默，这种转录后的基因沉默机制称为RNA干扰(RNA interference，RNA i)[1]。小分子干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)是一类长约21-23个核苷酸单位的dsRNA分子，是RNA i发挥作用的中间效应分子，它可以是内源性的或外源性的[2]。虽然RNA i技术可在哺乳动物体外培养的细胞中广泛应用，但其在体内的应用还是很有限的[3]。这主要是由于siRNA的核酸本质所致：(1)由于血浆中核酸酶的存在，siRNA的半衰期不到15m in[4]；(2)siRNA的本质为核酸，其负电性与极性导致其很难穿过脂质双分子层的细胞膜，裸露的siRNA在体内不能快速透过血管内皮、滞留于脾脏等血液储存场所、易于被肾小球滤过、以及被细胞内的核酸酶降解[5]；(3)siRNA的脱靶效应[6]；(4)siRNA的免疫原性刺激[7,8]。随着RNA i在研究基因功能、治疗遗传相关疾病以及抗癌药物方面的快速发展，siRNA的体内运送成为备受关注的问题。因此，要将siRNA分子成功导入生物体并发挥有效的治疗作用，首先应解决载体问题。由于生物体内直接应用siRNA分子的限制，大多数研究都借助于给药载体：包括病毒载体和非病毒载体两类。尽管病毒载体给药系统在体外的转染效率很理想，但是其有潜在的细胞毒性、免疫原性以及炎症反应使得其应用受到很大的限制[9]。非病毒载体包括多种载体方式给药，纳米粒载体是由生物材料制备的非病毒载体，粒径大小在 1～1000 nm。纳米粒在递送siRNA方面具有很多优点，比如提高siRNA在体内的稳定性，具有靶向功能，降低细胞毒性和免疫原性，增加细胞摄取和内化行为等，这些都有利于提高siRNA的基因沉默效率。此外，通过对已形成纳米粒递送系统的修饰，可进一步提高纳米粒在体内递送的稳定性，增加细胞的靶向功能以及促进siRNA在细胞质的释放等。非病毒纳米载体材料主要包括：聚合物材料、脂质材料和蛋白多肽类材料[10]。现分别就各类材料中的具体载体物质的结构和生物学特征作如下介绍。

1 高分子聚合物材料介导的siRNA给药系统

由于siRNA荷负电，荷正电的阳离子聚合物可以与之以静电结合力相组装，从而完成siRNA的包载。聚合物载体材料又可分为合成高分子聚合物与天然高分子聚合物。

1.1 合成高分子聚合物 该类化合物主要包括聚乙烯亚胺(polyethylenim ine，PEI)及其修饰物、聚丙交酯乙交酯(polylactide-co-glycolide，PLGA)、以及聚酰胺-胺型树枝状高分子(polyam idoam ine dendrimei，PAMAM)。

PEI及其修饰物分为分枝状和线状两种类型，相对分子质量为1×103至1×106，分枝状的转染效率优于线状[11]。PEI作为siRNA转染载体的机制为：PEI分子中大量的质子化氨基基团可以与 siRNA 形成非共价的高电解质分子复合物，被细胞内吞后，通过独特的“质子海绵效应”，增强质子和水的内流，导致细胞内涵体破裂释放出 siRNA 到胞浆[12,13]。但是PEI因其较高的分子量和较大的使用剂量而具有一定的毒性，通过对PEI结构的修饰来达到保持基因递送效率和降低毒性的平衡是目前研究的热点。通过偶联亲水性基团到PEI的结构上是一种解决PEI毒性问题的可行方法。但是耦合亲水性基团之后仍要能保持PEI一定的正电荷密度以达到稳定结合siRNA的能力。Oskuee 等人通过对PEI的羧基化来提高它的亲水性和中和PEI表面的一部分正电荷，修饰之后的PEI在没有降低它的“质子海绵”效应的前提下减少了毒性，提高了基因沉默效率[14]。Schiffelers等人将RGD环状三肽作为靶头修饰到PEG化的PEI表面，制备了靶向siRNA转染系统。结果表明该载体的靶向性能提高了，并且粒子半径减小至70～100 nm，稳定性增加[15]。

PLGA是乳酸和乙醇酸通过酯键连接的共聚物，在体内代谢的最终产物为二氧化碳和水，是一类无毒、生物可降解、生物相容性好的高分子材料。其包裹的siRNA被释放到细胞之中。执行相应的功能。研究表明影响PLGA纳米粒载体介导基因转染的因素主要有溶液pH、纳米粒与siRNA的比例等[16]。采用喷雾干燥技术制备的PLGA纳米球作为siRNA载体，可减小聚集并提高转染率[17]。近年来PLGA的修饰物大有发展。使用聚乙二醇-PLGA作为载体进行siRNA的体外运送试验结果显示：聚乙二醇化的PLGA载体材料可以增加其转染效率[18]。

树枝状大分子是有规律地高分散性排列的结构大分子，而且其结构形状、分子量大小和表面所带电荷均可以调整。这些特殊的结构使得树枝状大分子能够通过内部封装、表面吸附和化学偶联来装载药物。PAMAM近年来已经被广泛应用于基因药物治疗的载体研究。但在siRNA递送方面的研究还具有很大的潜力。PAM AM的化学结构表面上有伯胺基，内部有叔胺基。伯胺基可以与核酸分子结合，有效压缩核酸分子的粒径在纳米级范围内以促进细胞的摄取。而叔胺基则可以在核内体中引起“质子海绵”效应，从而促进核酸分子从核内体中的逃逸和在细胞质中的释放。

此外，树枝状高分子聚合物聚丙酰胺在递送siRNA方面也有研究，但是相对较少。Taratula研究发现，聚丙酰胺的代数越高，在与siRNA形成离散型纳米粒的程度就越好。但是随着代数的增加，粒径和表面电荷也随之增加，聚丙酰胺的毒性也不断增加[19]。

1.2 天然高分子聚合物 该类化合物由于其广泛的来源性以及良好的生物相容性，在siRNA传递方面备受关注。主要包括：壳聚糖、环糊精以及胶原蛋白。

壳聚糖是由壳多糖去乙酰化衍生而来的一类天然高分子多糖，主要存在甲壳动物和昆虫壳上。壳聚糖因其具有低毒性、低免疫原性以及出色的生物降解性和生物相容性等优点，已成为构成siRNA递送载体的常用材料。带正电荷的壳聚糖能够通过电荷作用力与带负电的DNA和siRNA络合形成基因递送系统。

为了提高壳聚糖载体递送s i R N A的效率，Opanasopit将壳聚糖分别与谷氨酸、醋酸和盐酸反应生成壳聚糖盐，然后再与siRNA通过静电相互作用形成递送系统。实验结果发现，影响壳聚糖/siRNA复合物形成的主要因素是壳聚糖的分子量以及壳聚糖与酸二者之间的质量比。低的壳聚糖分子量(20 kDa)和高的质量比形成的壳聚糖/siRNA具有高的基因沉默效率。他们还利用羟基苯并三唑与壳聚糖成盐后与siRNA结合形成复合物，在壳聚糖分子量为20 kDa，质量比高达80时，基因沉默效率能达到60%[20]。利用硫胺素焦磷酸的磷酸基团与壳聚糖上的氨基反应成盐后不但可以提高壳聚糖本身的水溶性，硫胺素焦磷酸上的氨基具有优越的“质子海绵”效应，这些性质可以大大提高siRNA在体内的基因沉默效率[21]。有研究显示：利用维生素E的琥珀酸盐与不同分子量的寡聚壳聚糖进行偶联得到两亲性的α-生育酚-寡聚壳聚糖。实验结果表明，在寡聚壳聚糖的分子量为4 kDa时得到的siRNA递送载体能够显著提高siRNA的细胞摄取(＞98%)和沉默效率[22]。另有文献表明，经过RGD修饰的壳聚糖/siRNA递送系统能够高效和有选择地输送到肿瘤细胞[23]。

环糊精具有外缘亲水而内腔疏水的独特的几何结构特征，因而在包载疏水性药物方面具有明显的优势。尽管在递送质粒DNA有较多的研究，但是有关用它递送siRNA的研究并不多。Dav is研究合成了一种新型递送系统-环糊精聚合物，利用聚合物所带的正电荷与siRNA通过电荷相互作用自组装形成纳米粒，能成功地将siRNA递送到靶细胞中[24]。实验结果表明，利用这种新型的基因递送载体递送siRNA能够显著抑制小鼠转移尤文氏肉瘤的生长速度。

胶原蛋白是一类天然高分子物质，具有生物可降解以及良好的生物相容性， Takeshita等人通过将等体积的胶原蛋白与siRNA溶液相混合，制备了一种siRNA/胶原蛋白复合物[25]，体外试验测定其具有长循环特性和癌组织蓄积性，并且无免疫原性。但是相关研究还是比较少的。

2 脂质材料介导的siRNA输送系统

脂质体是由磷脂、胆固醇等膜材包合而成，具有类似生物膜结构的双分子层囊泡。用于包载siRNA的主要为中性脂质体与阳离子脂质体。中性脂质体可用于体外siRNA的递送。其脂质材料包括：二油酰磷脂酰胆碱等。但是中性脂质材料由于其结构特点，并不常单独用于siRNA的递送，而是较多地与阳离子脂质体联合应用。用于siRNA递送的脂质体多为阳离子脂质体，常用的阳离子磷脂有1，2-二油酰基-3-三甲基氨基内烷、N-[1-(2，3-二油酰)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵、二油酰基磷脂酰乙醇胺、胆固醇等。M o rrissey采用阳离子脂质、致融类脂和聚乙二醇化的磷脂形成磷脂双分子层，把两种siRNA分子，HBV263和HBV1583，依靠电荷相互作用包载进水溶性中心之后，形成了一种稳定的脂质体。它不仅可以促进细胞摄取和核内体逃逸，而且大大增加在体内循环系统的时间，提高了siRNA对肝炎病毒的干扰作用[26]。但是，由于阳离子脂质材料的细胞毒作用，其应用还是很有限。但是随着材料的不断进步，二油酰基磷脂酰乙醇胺等已经比1，2-二油酰基-3-三甲基氨基内烷的毒性小了很多，可用于体内外的试验当中。

3 多肽类介导的siRNA递送系统

因为多肽的低毒性，常常用来作为核酸的运送载体材料。但是，相对于其他阳离子材料来说，它不能有效地压缩核酸以及在细胞质中释放核酸，因此在用作核酸的载体材料时研究人员会选择性对其加以修饰。聚天冬氨酸二乙基色胺(聚天冬氨酸的一种衍生物)具有PH敏感的裂解核内体作用[27]。它能裂解细胞膜可能是因为在核内体的PH条件下，它分子中的1,2-二氨基乙烷能形成双质子，从而具有“质子海绵”效应。因此可以在不引起细胞毒性的情况下，高效的对核酸进行转染。

4 新材料的构想设计

基于上述几类siRNA的非病毒纳米载体的介绍，不难发现其中各有优劣，因此将其联合应用或者进行新材料设计是势在必行的。根据siRNA荷负电以及易于被核酸酶水解的特性，制备成纳米材料将其包被在内部可以增加其稳定性。Yelena Vachutinsky等人曾设计了一种聚合物胶束用于靶向新生血管的质粒DNA的传递[28]，在其基础上构想了一种新的siRNA的载体材料。将聚乙二醇与巯基化的壳聚糖形成嵌段共聚体，经过二硫键的固化交联形成嵌段共聚物纳米粒，其中聚乙二醇为亲水性，位于胶束外侧，而壳聚糖部分含有多个荷正电氨基，位于胶束内核处，并与siRNA通过静电结合作用结合，将其包裹于内部。现以靶向肿瘤新生血管的siRNA的递送系统为例加以说明。

RGD为整合素受体αv家族的一个识别模块，将其修饰于该聚合物胶束外侧，可完成对新生血管的靶向作用[29,30]。参考Yelena Vachutinsky等人制备二硫键交联的嵌段共聚物胶束，二硫键的作用可以提高该胶束在细胞外的稳定性，故将壳聚糖巯基化，并与聚乙二醇相接构成嵌段共聚物。经固化交联作用形成稳定的胶束。由于聚乙二醇与壳聚糖具有良好的生物相容性与生物可降解性，而RGD具有良好的新生血管靶向性，推测该结构将会成为一个比较理想的siRNA的传递系统。

5 小结与展望

从发现双链RNA在线虫体内可以干扰特定基因的表达，RNA干扰现象就引起了全球关注，siRNA作为疾病治疗药物的前景逐渐被医药学工作者认识。为了有效递送siRNA到内体发挥基因沉默效应，种类多样的非病毒载体的研究得到了快速发展。但是要使siRNA治疗在临床上得到成功应用，siRNA的递送仍然是横亘在实验室研究与临床应用之间的壁垒。因此，研究和开发安全有效的递送材料和递送系统将是基因治疗研究的热点。

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