Pim—1在人宫颈鳞癌组织中的表达及临床意义

刘芳梅　张继红　闫婷婷

【摘要】 目的：研究Pim-1基因及其蛋白在宫颈鳞癌组织中的表达水平，探讨其与宫颈鳞癌临床特性之间的关系。方法：采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）半定量方法和免疫组化学法，检测46例宫颈鳞癌组织和10例正常宫颈组织标本中Pim-1基因及蛋白的表达情况。结果：宫颈鳞癌组织中Pim-1基因与蛋白的表达水平明显高于宫颈正常组织（P<0.05）；Pim-1蛋白在宫颈鳞癌组织中的表达与组织学分级、临床分期和淋巴结转移密切相关（P<0.05）。结论：原癌基因Pim-1及其蛋白在宫颈鳞癌组织中过度表达，可能与宫颈鳞癌的发生、发展有关。

【关键词】 宫颈鳞癌； 反转录-聚合酶链反应； 免疫组化； Pim-1基因

Pim-1基因最早在莫洛尼小鼠白血病病毒诱导的T-细胞淋巴瘤中被发现的[1]，其编码的Pim-1蛋白激酶具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性，参与调节细胞增殖、分化与凋亡等。已有大量的研究表明Pim-1在人类多种肿瘤组织中高表达。但关于Pim-1在宫颈癌组织中的表达情况研究报道甚少。本研究应用RT-PCR方法和免疫组化学法分别检测了Pim-1基因和其蛋白在宫颈鳞癌中的表达情况，初步探讨了Pim-1基因与宫颈鳞癌发生、发展的关系，并且为以后深入研究提供了相关理论依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源 所有标本均来自郑州大学第一附属医院妇产科2009-2011年手术治疗且术后经病理科证实为宫颈鳞癌患者46例（恶性组）、多发性子宫平滑肌瘤患者10例（正常组），所选患者术前均未进行放疗和化疗。取所有入选病例术中切除的新鲜宫颈组织标本，均分作两份，一份立即放入液氮中保存，用于做RT-PCR实验；另一份用福尔马林溶液固定、石蜡包埋，用于做免疫组化实验。

1.2 试剂 RT-PCR所用试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司，引物是由北京赛百盛生物技术有限公司合成：Pim-1上游引物序列为5' CGATGGGACCCGAGTGTA 3'，下游引物序列为5' TGGAGGTGGATCTCAGCAGT 3'，扩增片段为312 bp；内参照β-actin的上游引物序列为5' CTGGGACGACATGGAGAAAA 3'，下游引物序列为5' AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC 3'，扩增片段为564 bp。SP试剂盒和DAB显色剂购于北京中杉金桥生物技术有限公司，兔抗人单克隆抗体Pim-1购于美国EPITOMICS公司。

1.3 实验方法

1.3.1 RT-PCR 取约100 mg宫颈组织，按Trizol提取试剂盒说明提取各组织总的RNA，紫外分光光度计检测RNA的纯度和浓度，反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA。取逆转录产物2 ?L，按PCR试剂盒说明进行。Pim-1引物扩增条件为：94 ℃预变性2 min，1个循环；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共30个循环；72 ℃总延伸6 min。取上述扩增产物5 ?L与缓冲液混合后加入2%琼脂糖凝胶的加样孔中，进行电泳。EB染色，用紫外线投射仪观察电泳条带，拍照并记录，用D-140图像记录分析系统进行分析，得出Pim-1 mRNA相对表达量。以正常宫颈组织作为对照。

1.3.2 免疫组化 采用免疫组化链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶（SP）法检测Pim-1蛋白的表达，具体操作按试剂盒说明书进行。染色结果判定：Pim-1在光镜下进行分析，随机选择5个高倍视野共计数200个细胞，在排除非特异性染色的前提下，胞浆/胞核出现淡黄色至黄棕色或棕褐色为阳性染色。计分方法：（1）染色程度：无着色计0分，淡黄色计1分，黄色计2分，黄棕或棕褐色计3分；（2）阳性细胞百分率≤5%计0分，6%～25%计1分，26%～50%计2分，51%～75%计3分，≥76%计4分。评判标准（A×B）≤1为阴性表达，>1为阳性表达。

1.4 统计学处理 应用SPSS 16.0软件学软件对数据进行处理，计量资料应用Kruskal-Wallis检验，计数资料采用 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同宫颈组织中Pim-1基因及蛋白的表达 Pim-1基因在宫颈鳞癌组织中的表达水平为（1.361±0.122），明显高于正常宫颈组织的（0.023±0.002），差异具有统计学意义（P<0.05）。Pim-1蛋白在宫颈鳞癌组织中阳性表达例数为35例（76.1%），高于正常宫颈组织的3例（30.0%），差异有统计学意义（字2=6.026，P=0.014）。

2.2 宫颈鳞癌中Pim-1蛋白的表达与临床特征的关系 Pim-1蛋白在宫颈鳞癌组织中的表达与组织学分级、临床分期和淋巴结转移密切相关（P<0.05）。见表1。

3 讨论

宫颈癌的发生发展是一个多因素、多步骤、多基因调控的长期过程，随着早期诊断技术不断进步如液基细胞学检测及阴道镜等[2-3]，很多宫颈癌前病变得到早期诊断和治疗，从而降低了宫颈癌的发病率，治疗上除了手术、放化疗、药物治疗等，介入治疗也在宫颈癌的治疗中得到广泛应用[4-5]，治疗方案更加合理化，死亡率也得到了明显下降，然而宫颈癌治疗后仍然存在着复发和转移，甚至导致病死。故继续探索宫颈癌的疾病发生、发展的机制，积极寻找新的诊断、治疗靶点具有重要意义。

国内外研究证实Pim-1参与调节细胞增殖、分化与凋亡，在多种肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用，例如He等[6]和张彤等[7]研究指出用QRT-PCR检测Pim-1 mRNA，可为诊断前列腺癌提供一个可靠的标准，提示Pim-1在前列腺癌发生、发展中发挥重要作用，可能成为前列腺癌诊断和预后判断的标志物；李晓晶等[8]研究表明Pim-1在肺癌组织中高表达，并且与肿瘤的直径和TNM分期呈正相关，提示Pim-1与肺癌的发生和发展程度有关；Yi等[9]发现Pim-1在非小细胞肺癌组织中高表达，可能在非小细胞肺癌发生发展过程中发挥重要作用。同时，随着研究的深入，以Pim-1为肿瘤治疗靶点的研究也日益引起了众多学者的关注，例如Mumenthaler等[10]发现Pim激酶抑制剂与化疗联合可以改善前列腺癌在临床治疗中的耐药情况；Shengjie等[11]研究发现沉默Pim-1可以明显抑制膀胱癌细胞生长，并且可以增强膀胱癌细胞在体外对化疗药物的敏感性。本实验结果表明Pim-1基因及其编码的蛋白在宫颈鳞癌组织中表达水平均明显高于正常宫颈组织，提示Pim-1与宫颈鳞癌的发生有关。在对Pim-1蛋白与宫颈鳞癌病例临床特征进行分析后发现Pim-1蛋白表达水平与宫颈鳞癌分期、分级、淋巴结转呈正相关，进一步提示Pim-1可能在一定程度上可以反映宫颈鳞癌的进展情况，为临床预测宫颈鳞癌的预后提供一定的理论依据。但由于本实验病例及实验方法的局限性，Pim-1与宫颈癌的具体关系及机制仍有待于进一步的研究与探讨。

综上所述，Pim-1可能参与了宫颈鳞癌的发生发展，并且可能成为宫颈鳞癌诊断和预后判断的标志物，另外以Pim-1为靶点的治疗方法有可能为临床治疗宫颈鳞癌开辟一条新的路径。

参考文献

[1] Cuypers H T，Selten G，Quint W，et a1.Murine leukemia virus-induced T-cell lymphomagenesis： integration of proviruses in a distinct chromosomal region [J].Cell，1984，37（1）：141-150.

[2]孙翠琴，范洪斌.液基细胞学检测在宫颈癌早期筛查中的价值[J].中国医学创新，2012，9（31）：77-78.

[3]王秀平.TCT及阴道镜在宫颈病变诊断中的应用分析[J].中国医学创新，2011，8（26）：117-119.

[4]刘继勇，蔡玉鸣.子宫颈癌的介入治疗[J].中国医学创新，2012，9（20）：119-120.

[5]李娟.局部晚期宫颈癌手术前行动脉灌注介入先期化疗的临床分析[J].中国医学创新，2011，8（21）：173-174.

[6] He H C，Bi X C，Dai Q S，et al.Detection of Pim- 1 mRNA in prostate cancer diagnosis[J].Chin Med J（ Engl），2007，120（17）：1491-1493.

[7]张彤，徐勇，张晓光，等.前列腺癌中 Pim-1的表达及其临床意义[J].中华泌尿外科杂志，2006，27（9）：621-623.

[8]李晓晶，孙丹，刘桐林，等.Pim-1蛋白激酶在肺癌组织中的表达及临床相关性研究[J].中国现代医学杂志，2011，21（7）：793-796.

[9] Yi Jin，Da-yue Tong.Expressions of Osteopontin （OPN）， αvβ3 and Pim-1 Associated with Poor Prognosis in Non-small Cell Lung Cancer （NSCLC）[J].Chin J Cancer Res，2012，24（2）：103-108.

[10] Mumenthaler S M，Ng P Y，Hodge A，et al.Pharmacologic inhibition of Pim kinases alters prostate cancer cell growth and resensitizes chemoresistant cells to taxanes[J].Mol Cancer Ther，2009，8（10）：2882-2893.

[11] Shengjie Guo，Xiaopeng Mao，Junxing Chen，et al.Overexpression of Pim-1 in bladder cancer[J].Jexp Clin Cancer Res，2010，24（29）：161-168.

（收稿日期：2013-12-12） （本文编辑：蔡元元）

综上所述，Pim-1可能参与了宫颈鳞癌的发生发展，并且可能成为宫颈鳞癌诊断和预后判断的标志物，另外以Pim-1为靶点的治疗方法有可能为临床治疗宫颈鳞癌开辟一条新的路径。

参考文献

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（收稿日期：2013-12-12） （本文编辑：蔡元元）

综上所述，Pim-1可能参与了宫颈鳞癌的发生发展，并且可能成为宫颈鳞癌诊断和预后判断的标志物，另外以Pim-1为靶点的治疗方法有可能为临床治疗宫颈鳞癌开辟一条新的路径。

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（收稿日期：2013-12-12） （本文编辑：蔡元元）