阿尔茨海默病的体液生物标记物研究进展

别立展，倪秀石

(上海交通大学附属第一人民医院，上海 200080)

阿尔茨海默病的体液生物标记物研究进展

别立展，倪秀石

(上海交通大学附属第一人民医院，上海 200080)

阿尔茨海默病；体液生物标记物；β-淀粉样蛋白；tau蛋白

阿尔茨海默病(AD)由德国精神病和神经病理学家Alois Alzheimer于1906年最早提出，是一种受年龄和遗传等多种因素影响的慢性神经退行性疾病。在各种易患因素中，年龄是AD最重要的影响因素，在65岁以上人群中，AD的发生率约为5%，而95岁以上人群中则高达40%～50%[1]。AD以渐进性遗忘及相继其他认知功能障碍、行为异常、神经心理改变为特征；发病隐匿，呈进行性不可逆性进展。病理学上以神经炎性斑(NPs)又称老年斑(SPs)、神经原纤维缠结(NFTs)和脑血管淀粉样变性(CAA)为典型病理特征[2]。脑组织内淀粉样蛋白质片段异常增加或聚集是导致神经元死亡的主要原因。由于起病隐匿，早期诊断一直是困扰AD的瓶颈。随着对轻度认知功能损害(MCI)和生物标记物的研究深入，2011年美国国家衰老研究所(NIA)和阿尔茨海默病学会(AA)发布了新的AD诊断标准，NIA-AA诊断标准提出了全新的理念，将AD视为一个连续的疾病过程，分为AD所致痴呆(dementia due to AD)、AD所致轻度认知损害(MCI due to AD)以及临床前AD(preclinical AD)。新的AD诊断标准引入了生物标记物，为AD的临床诊断提供辅助依据。AD生物标记物包括体液(脑脊液和血液)生物标记物、风险基因标记物和脑成像标记物等。本文就AD体液生物标记物的研究进展综述如下。

1 脑脊液生物标记物

1.1 β-淀粉样蛋白(amyloid-β，Aβ) Aβ是β-淀粉样前体蛋白(APP)的一个肽段，含有39～42个氨基酸的多肽，因在三维结构中呈β折叠，故称“β-淀粉样蛋白”。Aβ具有较强的自聚性，容易形成极难溶解的沉淀，为老年斑的主要成分，是AD的神经病理学标志。Aβ由APP通过蛋白酶裂解而形成，APP位于第21号染色体上，含有19个外显子，广泛存在于全身组织细胞上，在脑组织表达最高。APP有2个水解途径，产生不同的代谢产物：①APP在β和γ分泌酶的共同作用下生成β-淀粉样多肽Aβ40和Aβ42。研究表明，Aβ42是一种不溶性多肽，更易形成斑块样的沉积，是老年斑的核心蛋白，而Aβ40则更易形成典型的纤维，起到延长老年斑的作用，Aβ42必须在Aβ40聚集的情况下才能聚集[3]；②APP由α-分泌酶在Aβ序列16～17位氨基酸之间水解，产生可溶性αAPPs和C83片段多肽。C83再经γ分泌酶作用产生较小的片段P3和另一胞内APP的C端(AICD)片段。目前已知αAPPs具有神经营养和神经保护作用，与学习、记忆功能有关[4]。Aβ具有多重毒性机制：Aβ可以诱导脑神经元产生氧自由基，使神经细胞的膜结构破坏而功能受损；Aβ可以改变神经递质和信号分子的分布，使细胞内游离钙离子增多；Aβ可通过多种途径引发线粒体功能紊乱、轴浆运输功能障碍、神经元丢失[5-7]。虽然有观点认为Aβ不是AD发病的始动因素，而是其他病理过程的次发事件，是神经细胞损伤的结果，但目前绝大多数的研究认为Aβ浓度的变化是启动AD发病的级联反应，并最终导致AD发病的主要因素。Höglund等[8]对MCI患者脑脊液中Aβ水平进行为期4～6 a的随访研究，结果发现，脑脊液中Aβ水平预测MCI发展为AD的敏感性为91%，特异性为64%，随着随访时间的延长，特异性增加到94%。Thaweepoksomboon等[9]检测比较14例AD患者和16例非AD痴呆患者的脑脊液Aβ1-42浓度，发现有12例AD患者、8例非AD痴呆患者的脑脊液Aβ1-42浓度小于截断值487 ng/L，其诊断AD的敏感性为85.71%，特异性为50%。Buchhave等[10]对137例MCI患者进行10 a的随访，其中72例最终进展为AD。5 a内进展为AD的早期转化患者和5～10 a内进展为AD的晚期转换患者的脑脊液Aβ42平均浓度分别为333 ng/L和359 ng/L，取截断值为<505 ng/L时，预测AD转化为MCI的敏感性为90%，特异性为76%，约登指数(Youden Index)为0.66，阳性预测率为81%，阴性预测率为87%，证实MCI患者脑脊液的Aβ42浓度可以提前10 a预测是否转化为AD。Bateman等[11]对128组家族性AD(FAD)患者的脑脊液中Aβ的水平随访研究发现，Aβ水平的下降比临床表现早25 a，比PET成像技术发现脑内Aβ沉淀物早10 a。

1.2 总tau蛋白与磷酸化tau蛋白 细胞内的NFTs主要由双螺旋纤维聚集而成，病理的双螺旋纤维主要是由过度磷酸化的tau蛋白组成。tau蛋白基因位于17号染色体长臂。正常人群中由于tau蛋白mRNA剪辑方式不同，可表达出6种同分异构体。tau蛋白为含磷酸基蛋白，正常成人脑中tau蛋白分子含2～3个磷酸基。tau蛋白从结构上可以被分成两大结构域：突出区和微管结合区，突出区包括分子N端2/3的部分，而微管结合区域包括分子C端的1/3的部分。在各个区域中，有一些特定的结构域主导了tau蛋白的特征和功能。tau蛋白的主要生理功能是促进微管自聚集和稳定微管，这点对于神经元胞内物质的传输至关重要。此外，tau蛋白与其他结构和功能蛋白的结合也表明了tau蛋白可能不仅在正常的骨架结构上，而且在神经元的信号转导上都扮演了重要的角色。tau蛋白通过磷酸化也同样可参与细胞发育的调节。tau蛋白主要分布于中枢和周围神经系统的神经细胞轴突中。在正常发育过程中，tau蛋白经历各种翻译后修饰，包括磷酸化、糖基化、泛素化、硝基化等，tau蛋白翻译后修饰已经被广泛研究，研究人员在大量的神经退行性疾病中发现了翻译后修饰程度加深的tau蛋白。在众多的翻译后修饰中，磷酸化被研究的最为广泛。在AD患者脑中，磷酸化水平是正常tau蛋白的3～4倍。tau蛋白过度磷酸化是蛋白激酶和蛋白磷酸化酶调节失衡的结果，脑脊液中p-tau的浓度能反映出脑内tau蛋白的磷酸化状态。到目前为止，AD中大概发现了30个tau蛋白的磷酸化表位，有研究证实[12]，p-tau可在MCI患者中鉴定出潜在的AD患者。对于非特异性脑损伤如急性脑卒中， p-tau含量不会如t-tau般升高，这更说明p-tau对NTFs形成的特异性，作为AD和其他疾病的鉴别诊断，p-tau有更高的敏感性和特异性。研究最为广泛的是p-tau181和p-tau231，脑脊液中p-tau181含量的升高则反映病情由MCI 向AD恶化，且认知能力迅速下降；脑脊液中p-tau231的含量不仅与大脑新皮质的NTFs相关，还与海马的萎缩密切相关[13]。Thaweepoksomboon等[9]对30例痴呆患者的研究提示，AD患者与非AD痴呆患者相比，脑脊液中t-tau(≥425 ng/L)和p-tau-181(≥61 ng/L)浓度升高的敏感性仅为7.14%和0%，而特异性高达100%和93.75%。有研究提示，t-tau变化仅能反映轴突损伤的程度，而p-tau在海绵状脑病或额颞痴呆等非AD神经系统变性性疾病中未见升高，可能更适合于AD的早期诊断[14]。

1.3 Aβ1-42与p-tau蛋白联合 Aβ1-42与p-tau蛋白的联合检测对AD早期诊断有很高的敏感性、特异性和预测价值，特别值得一提的是p-tau181/Aβ42组合，被认为是目前最好的脑脊液生物标记物的诊断组合[15]。Tapiola等[16]对123例患者(79例AD、29例其他类型的痴呆、15例其他神经系统疾病脑脊液中Aβ42和p-tau的浓度)进行13 a的连续随访检测，Aβ42的最佳截断值为小于515 ng/L，p-tau的最佳截断值为大于52.5 ng/L，p-tau/ Aβ42比率的最佳截断值为大于0.0867，其联合诊断的敏感性为91.6%，特异性为85.7%，与通过病理途径发现AD患者脑内神经炎性斑的吻合度达到了90.2%，结果令人振奋。同样，Thaweepoksomboon等[9]通过ELISA法对30例痴呆患者(14例AD患者和16例非AD患者：5例血管性痴呆，5例正常压力脑积水，4例额颞叶变性和2例其他类型痴呆)的Aβ1-42和p-tau的检测结果提示：Aβ1-42与p-tau联合诊断AD的敏感性为92.9%，特异性为100%，与Aβ1-42或p-tau单项相比，诊断AD的敏感性和特异性均有提高。Buchhave等[10]的研究则提示Aβ42/p-tau的比率(截断值为<6.16)对AD早期诊断的敏感性为88%，特异性为90%；如果进一步结合t-tau的升高(截断值>350 ng/L)，则诊断的准确率会进一步提升，但有相当一部分临床前AD的t-tau是不升高的，从而限制了其应用。随着研究的深入和检测水平的提升，2个或更多的生物标记物组合应用于AD的临床诊断，其可靠性和实用性将会进一步提高。

1.4 淀粉样前体蛋白β-位裂解酶1(BACE1) BACE1是1999年被发现的新型跨膜天冬氨酸蛋白酶，是Aβ产生过程中起决定作用的限速酶。BACE1在多种组织中有表达，但只在脑和胰腺中有高表达。在神经元中的BACE1活性较高。BACE1的一级结构含有501个氨基酸残基，从N-端到C-端分别是一段含21个氨基酸残基的信号肽、跨度从22～45号残基的前蛋白结构域、从46-460号残基的成熟蛋白腔内结构域、含17个残基的跨膜结构域和含24个残基的胞内部分。BACE1的催化区含有2个高度保守的活性位点，分别是DTG(93-95)和DSG(289-291)，突变其中任意一个活性位点都会导致蛋白酶失去活性。BACE1降解通过2条途径进行：一条是泛素-蛋白酶体化途径，使用蛋白酶体抑制剂可以减少BACE1的降解，增加下游产物C99和Aβ的表达[17]；另一条即自噬体-溶酶体途径。APP具有促进和维护神经元生长的生理作用，先后被β分泌酶和γ分泌酶水解后产生不溶性Aβ肽段，其β分泌酶的主要酶活力来自BACE1，而脑脊液BACE1的活性能较好地反映其脑内的活性。研究发现，BACE1的浓度和活性在AD和MCI患者中均升高[18]，在AD患者脑中，有Aβ沉积的前皮质BACE1表达量是无Aβ沉积的小脑的3倍[19]。Jeppsson等[20]发现，在小鼠、豚鼠和非人类的灵长类动物使用BACE1抑制剂(AZD3839)可以有效减缓脑脊液中Aβ水平的下降，抑制脑内Aβ的沉积，目前该药已进入I期临床试验，随着试验的进展，期待有更多的研究成果。

1.5 人类软骨糖蛋白-39(YKL-40) 其属于哺乳动物18-糖基水解酶家族的成员, 因其一条肽链氨基端的起始氨基酸为酪氨酸、赖氨酸和亮氨酸, 相对分子质量约为40 000而被称为YKL-40，可以被活化的巨噬细胞、血管平滑肌细胞、活化的星形胶质细胞及肿瘤细胞表达。YKL-40在动脉粥样硬化的发生发展过程中发挥着重要作用，在动脉粥样硬化、冠心病及心肌梗死等血管性疾病中表达水平升高，并与病情程度及预后有相关性[21]。异常的星形胶质细胞是与淀粉样蛋白斑块相关的一小部分，类似于脑脊液tau蛋白，在AD的早期阶段(非常轻微的痴呆/ MCI)脑脊液YKL-40的增高就已经非常明显[22-23]。因此，作为生物标志物的YKL-40可以监测AD病理学的非常早期阶段的变化。另外有研究显示，脑脊液中YKL-40表达水平与Aβ42/p-tau181比率联合可以提高AD患者诊断的准确率[23]。

1.6 其他新的生物学标记物 与正常老年人相比，AD患者的听觉皮质、嗅觉皮质和海马区域的突触体相关蛋白25(SNAP25)明显下降[24]；AD患者脑脊液中细胞因子(如IL-1b、IL-2、IL-10、IL-12p70、GM-CSF、IFN-g、TNFα)明显升高，但相关机制仍不清楚[25]。还有一些生物标记物如心型脂肪酸结合蛋白(heart-FABP)[26]和胰多肽等[27]目前研究资料较少，随着研究的深入，相信有更多的对AD诊断有特异性的脑脊液的生物标记物会被发现。

2 血液生物标记物

脑脊液样本采集的严格适应证、禁忌证及采集技术都限制了其被广泛应用。相对于脑脊液样本，血液样本的采集更加简易、方便。但由于血脑屏障的存在，血液中生物标志物的特异性和敏感性必然下降。血液中的生物标记物包括血浆生物标记物和血细胞生物标记物。

2.1 血浆生物标记物

2.1.1 Aβ 既往研究显示，脑脊液和血浆中的Aβ通过受体介导的双向运输而达到动态平衡，血浆中Aβ含量在一定程度上反映了Aβ的代谢程度[28]。在FAD患者中，血浆Aβ水平在发病以前表现为升高，但随着病情的进展而逐渐下降。Toledo等[29]对715例受试者(348例MCI患者，162例AD患者，205例正常人)进行为期3 a的研究，认为MCI或AD患者的外周血Aβ40、Aβ42浓度较正常参照组会有一些变化，对MCI或AD的早期发现可能有一定的预测能力，但诊断价值有限。Yaffe等[30]对997社区老人进行为期9 a的随访研究，同时检测血液中Aβ40、Aβ42的浓度和Aβ42/Aβ40比率，证实Aβ40含量升高、Aβ42含量降低及Aβ42/Aβ40比率降低与认知功能衰退、直至进展为痴呆的风险之间是有关联的，在校正了年龄、种族、学历、吸烟等多种因素后，这种关联仍然具有统计学上的显著意义；并且血浆Aβ42浓度与认知功能衰退之间也存在显著的相关性，但血浆Aβ40浓度与基线认知功能或认知衰退之间未显示相关性。血浆中Aβ作为AD标记物仍需要更多的研究来确认。

2.1.2 抗Aβ抗体 正常人血浆中存在活性多样的抗Aβ的IgG、IgM，这些抗体或抗原抗体复合物与Aβ的动态平衡有利于维系APP代谢的稳态[31]。AD患者可能存在清除Aβ的免疫缺陷，从而加速AD的病理生理进程，但迄今为止，研究结果仍没有明确的结论，而且血浆Aβ抗体的检测存在诸多影响因素，影响其检测的灵敏性。

2.1.3 tau蛋白 与脑脊液相比，血浆中tau蛋白含量常常低于可检测的阈值，目前常规的tau蛋白检测方法都不能检出，因此，迄今为止关于外周血液循环中tau蛋白含量的数据仍然很少。至于AD患者脑脊液tau蛋白水平的升高是否可能引起血液中tau蛋白水平的升高，目前尚无定论[29]。

2.1.4 分子伴侣 分子伴侣是一类广泛存在、高度保守的蛋白质。一个蛋白质从翻译出来开始一直到它被降解为止，都离不开分子伴侣的陪伴。新生肽链的折叠、装配、运输、细胞内定位、蛋白质复合体的装配、受到损伤后的修复以及最终被蛋白酶体或溶酶体降解都需要分子伴侣的参与，同时分子伴侣还参与了多条信号转导通路的调节、细胞凋亡的调控和免疫反应中抗原的提呈等细胞重要活动。细胞外液中存在大量的Aβ分子伴侣，参与Aβ聚集或清除，与AD发病密切相关[32]。

2.1.4.1 丛生蛋白 作为Aβ胞外的伴侣蛋白，丛生蛋白广泛存在于体液中，可以与一系列蛋白结合，参于体内多种代谢过程，具有重要的生物学功能。在外周，由肝细胞分泌，肝脏、肾脏等组织高表达。在血浆中，主要与人体内高密度脂蛋白颗粒结合，约30%与血小板结合。在中枢，主要由星形细胞分泌，在脑脊液中，丛生蛋白亦主要与高密度脂蛋白结合。由于在血浆和脑脊液中均与脂质成分结合，发挥载脂蛋白的功能，丛生蛋白也称载脂蛋白J(ApoJ)。有研究认为[33]丛生蛋白在AD的病理生理进程中具有保护作用，其可能的作用途径：①与Aβ片段结合，阻止其聚集；②与低密度脂蛋白受体相关蛋白Ⅱ(LRP-2)受体结合，增强小胶质细胞对Aβ片段及Aβ纤维原的吞噬作用；③为一种补体抑制剂，可以抑制AD病理性补体的激活；④同样存在于脂蛋白微粒，对AD患者中存在的胆固醇及脂质代谢的紊乱具有重要调节作用；⑤应激情况下，大部分丛生蛋白分泌至胞外，小部分丛生蛋白可与胞质内相关信号转导分子结合，抑制神经元凋亡或增强神经保护因子和转化生长因子的信号转导。Thambisetty等[34]研究发现，血浆丛生蛋白水平与AD患者的脑萎缩、疾病严重程度以及临床进展相关，而且观察到，在临床进展较快的AD患者，血浆丛生蛋白浓度增高。进一步研究证实，外周血浆中丛生蛋白是AD患者脑内病理变化的生物标志，并且其浓度的升高与AD进展速度及病情严重程度相关[35]。Schrijvers等[36]为评估丛生蛋白与AD病情严重程度和发病风险的相关性，检测了60例AD患者的基线丛生蛋白浓度，以及随机队列926例受试者和随访过程中156例新发AD患者的血浆丛生蛋白浓度，在校正年龄、性别、教育水平、吸烟、糖尿病、冠心病和高血压等因素后，发现丛生蛋白每增加一个标准差，AD患病风险上升49%、AD患者MMSE评分下降1.36，提示血浆丛生蛋白水平与AD的基线患病率和严重程度显著相关，但与AD发病率关系不明。

2.1.4.2 血清淀粉样P物质(SAP) SAP参与固有免疫、炎症反应和淀粉样病变等重要的生理病理过程。SAP可与所有类型的含淀粉样的原纤维结合，并且在淀粉样沉淀中广泛存在。SAP可与细胞外淀粉样纤维结合，抵抗蛋白酶的作用，使淀粉样纤维不被降解。研究发现SAP由激活的小胶质细胞产生与释放，并具有与Aβ结合、抑制Aβ纤维降解和促进其神经毒性的作用[37]。

2.1.4.3 触珠蛋白 触珠蛋白又称结合珠蛋白，是肝脏合成的一种α2球蛋白，约占血浆总蛋白的1%，能与血浆中游离的氧合血红蛋白结合形成复合物，为一种抗氧化蛋白，可能与AD的氧化应激相关。研究发现触珠蛋白在外周血中浓度的改变可能有助监测大脑淀粉样变化的进展[38]，但对AD的早期诊断未显示有明显的敏感性，且检测难度较大。

2.1.5 细胞周期蛋白 Song等[39]对176例受试者(74例AD患者、11例帕金森病患者、11例血管性痴呆患者、80例认知功能正常对照者)通过ELISA法检测外周血淋巴细胞中的细胞周期素E(Cyclin E)、周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、视网膜母细胞瘤肿瘤抑制蛋白(Rb)和转录因子E2F1，发现AD患者组的这四种细胞周期蛋白表达增加，与其他3组相比，显示有较高的敏感性(Cyclin E 81%、Rb 89%、CDK2 78% 、E2F-1 85% )和特异性(Cyclin E 84%、Rb 74%、CDK2 80%、E2F-1 85% )，表明细胞周期蛋白具有作为AD生物标志物的潜力，值得进一步研究。

2.2 血细胞生物标记物

2.2.1 血小板和APP 异构体蛋白在AD的发病过程中起重要作用，其降解产生的Aβ聚合体可以损伤突触和神经元。在外周细胞中，血小板由于其表达APP异构体的浓度与脑细胞相当而受到广泛关注。在血小板中，完整的APP将被加工成分子量为130，110，106 kD 3种异构体，高分子量(130 kD)和低分子量(110 kD和106 kD之和)比例称为APP异构体比值(APPr)，在AD患者中APPr下降且和疾病严重程度相关，敏感性和特异性在80%～95%，是评价AD疾病进程和治疗效果的理想标记物[40]。Zainaghi等[41]对34例MCI患者和21例AD患者研究随访4 a，发现血小板APPr在MCI进展为AD时显著降低，而且预测的准确性相当好，但其测定方法是基于蛋白印迹技术，并需光密度扫描进行浓度测定，由于技术上的局限性，与血浆中Aβ水平研究相比，仍需进一步大样本的研究。

2.2.2 外周血单核细胞(PBMC) 研究表明Aβ聚集和沉积可以引起脑内星形胶质细胞和小胶质细胞的异常激活，这些异常激活的细胞可以进一步分泌大量趋化因子(如补体片段C1q、C3b等)，趋化外周血单核细胞从微血管透过血脑屏障参与脑内Aβ寡聚体的吞噬和清除，但PBMC的这种功能在AD患者中存在明显损害，且这些参与Aβ清除的外周血单核细胞易于凋亡，最终导致血管周围Aβ的沉积[42]。检测PBMC对Aβ1-42的吞噬清除功能对AD早期诊断具有潜在的应用价值，值得进一步研究。

总之，随着人口老龄化不断加速，AD患者带来的医疗和社会负担日益严重。生物标记物为AD的机制研究、预防监控、早期诊断、病情评估和疗效评价提供了一个很有前途的方法。随着对AD发病机制的深入研究及相关检测技术的发展，更多的高灵敏性和特异性的生物标记物将会不断被发现。从临床前AD到AD所致痴呆，AD是一个连续的疾病过程。对AD的治疗也应该从“以治疗为主”逐渐向“防治并重”发展，并期待在不久的将来转变为“以预防为主”，让千千万万的AD患者能够摆脱阴影，享受有质量的生命和有尊严的人生。

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倪秀石，E-mail：drnixiushi@sina.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2014.34.041

R749.16

A

1008-8849(2014)34-3867-05

2013-10-25