野百合碱预处理对大鼠右心室功能及规范性瞬时感受器电位亚家族表达的影响

蔡克锋，陈慧勤，徐训发，林伟强，许朝祥，陈国桢

野百合碱预处理对大鼠右心室功能及规范性瞬时感受器电位亚家族表达的影响

蔡克锋，陈慧勤，徐训发，林伟强，许朝祥，陈国桢

目的：探讨腹腔注射野百合碱（MCT ）3周对大鼠右心室功能的影响以及规范性瞬时感受器电位（TRPC） 亚家族在野百合碱诱导的右心室心肌肥厚中的表达。

野百合碱；规范性瞬时感受器电位；心肌肥厚；Ca2+

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:928.)

慢性肺源性心脏病是由肺组织、肺血管或胸廓的慢性病变引起肺组织结构和功能异常，肺血管阻力增加，肺动脉压力增高，使右心室扩张、肥厚伴或不伴右心功能衰竭的心脏病。慢性肺源性心脏病80%～90%由慢性阻塞性肺疾病（COPD）引起，是严重危害人体健康的常见病，受到医学界的广泛重视。慢性肺源性心脏病发病过程中，早期的心肌肥厚可能是心肌细胞对外界的刺激的一种适应性改变，有一定的代偿意义，有利于维持心输出量，但长期的心肌肥厚最终会导致心力衰竭甚至猝死。因此，研究心肌肥厚的发病机制，寻找可行的治疗靶点对治疗慢性肺源性心脏病具有重要的意义。以往的研究发现Ca2+信号在诱导心肌肥厚发生发展过程中起到重要作用[1]，肥厚心肌细胞胞浆内Ca2+处于持续性高水平[2]，且降低细胞内钙离子浓度，能显著抑制心肌细胞肥大。目前的研究表明规范性瞬时感受器电位（TRPC）亚家族成员与Ca2+内流有关，它能调节细胞内的Ca2+浓度，参与细胞的肥大和凋亡[3]。TRPC亚家族有7种亚型，分别为TRPC1～7。TRPC通道可能参与了受体操纵的离子通道、钙池操纵的离子通道和牵张激活性离子通道。由于以往关于TRPC亚家族的报道一般是通过腹主动脉缩窄法诱导左心室心肌肥厚大鼠模型来进行研究的[4]，而野百合碱（MCT）诱导的右心室心肌肥厚的模型报道较少，本研究旨在明确MCT诱导的右心室肥厚大鼠模型的心肌细胞上哪些TRPC亚型介导的Ca2+内流参与了心肌肥厚的发病，从而为临床治疗慢性肺源性心脏病提供新的靶点和思路。

1 材料和方法

材料：本实验的起止时间为2012-08至2014-02。试剂包括：逆转录试剂盒（Takara，日本）、总核糖核酸抽提试剂Trizol（Invitrogen，美国）、ROX染料（RoMCTe，瑞士），引物（生工生物工程有限公司，上海），RIPA裂解液（碧云天，江苏）、PMSF蛋白酶抑制剂（碧云天，江苏）、化学发光试剂Novex ECL（Invitrogen， 美国），大鼠抗大鼠β-Actin抗体（Abcam，英国），兔抗大鼠TRPC6抗体（Abcam，英国），野百合碱（Sigma，美国）。仪器包括：O2浓度分析仪（ProOX-110 型， 美国BioSpherix公司）、O2浓度探头（E702型， 美国Bio Spherix公司）、压力换能器（YPJ01型， 成都仪器厂）、生物信号采集处理系统（ RM6240 型， 成都仪器厂）、冷冻高速离心机（Heraeus公司，德国）、StepOne实时聚合酶链反应（PCR）仪（ABI公司，美国）、BIO-RAD Mini Trans-Blot Cell 小型转印槽（Bio-Rad 公司，美国）、Mini-Protean Tetra 电泳槽（Bio-Rad 公司，美国）。

野百合碱诱导的大鼠模型的建立：健康SD大鼠，雄性，体质量 （200±20）g （上海斯莱克实验动物有限公司），共20只，随机分成对照组和MCT诱导组（MCT组）各10只。根据李波等[5]的研究，本研究采用MCT给药3周的方法。对照组：SD大鼠常压下饲养3周；MCT组：以2 % MCT 60 mg/kg剂量一次性腹腔注射后，再在常压下饲养3周。

右心室收缩压（RVSP）、右心室内压变化率（±dp/dtmax）的测定: 两组大鼠均分别腹腔注射肝素50 IU/100g，5 min再行后氨基甲酸乙酯1g/kg腹腔麻醉后，从右颈外静脉插管直到右心室，记录大鼠右心室收缩压、右心室内压力最大上升/下降速率（RV±dp/dtmax）。

右心肥大指数（ RVMI）的测定:右心室插管术后，迅速开胸取出心脏。沿房室交界处剪去左右心房及大血管，分离右心室（RV）及左心室（LV）、室间隔（S），用滤纸吸去多余水分，分别称重，计算RVMI=RV/（LV+S）。

右心室心肌组织形态学检测:麻醉大鼠开胸后迅速取出心脏，剪除大血管、心包膜、脂肪组织等，滤纸吸干，取右心室心肌靠心尖部组织块，置于4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，苏木素伊红（HE）染色心肌切片，光镜下观察心肌病理改变。

逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）法检测TRPC1/3/4/5/6/7 mRNA表达水平:β肌动蛋白及TRPC亚家族mRNA引物序列见表1，将约0.1 g右心室组织块在液氮中充分研磨后，加入Trizol 试剂，提取总核糖核酸（RNA），紫外分光光度法测定RNA的浓度及纯度。按照Takara逆转录试剂盒的说明书进行RT-PCR。用β肌动蛋白（β-actin） 抗体作为内参考进行实时定量PCR，建立一个10 μl PCR反应体系：H2O 4.15 μl，染料ROX 5 μl，PCR Forward Primer 0.3 μl，PCR Reverse Primer 0.3 μl，互补脱氧核糖核苷酸（CDNA） 0.25 μl进行PCR的扩增反应：①预变性 95℃10 min（1cycle）；②变性、退火、延伸95℃30s，60℃ 1min（40cycle）。

表1 β肌动蛋白及TRPC亚家族mRNA引物序列

蛋白质免疫印迹法（Western-blot）检测TRPC6蛋白表达水平：右心室心肌组织用液氮研磨后，加入RIPA细胞裂解液提取总蛋白，BCA法[6]测定蛋白质浓度，取40μg总蛋白进行Western-blot实验。12.5 %聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）电泳后行转膜印迹，分别用兔抗大鼠TRPC6抗体或大鼠抗大鼠β-Actin抗体（Santa Cruz Biotechnology，美国）与膜上的抗原结合，然后用相应的辣根过氧化物酶（HRP）耦联的二抗与其反应，用化学发光试剂Novex ECL（Invitrogen， 美国）检测，经压片曝光后显影和定影。采用Phoretix 1D图像分析软件分析各组蛋白表达情况。

统计学方法：采用统计软件Origin 6.1对所得数据进行分析，数据用均数±标准差表示，各组间均数比较采用成组t检验分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

两组大鼠右心室血流动力学和心室肥厚程度比较：MCT组与对照组比较， 右心室收缩压、右心室肥大指数显著升高，右心室内压力最大上升速率显著增加，右心室内压力最大下降速率 显著下降，差异均有统计学意义（P＜0.01）。两组间平均体循环动脉压差异无统计学意义（P＞0.05）。表2

表2 两组大鼠右心室血流动力学参数和右心室肥大指数的比较

表2 两组大鼠右心室血流动力学参数和右心室肥大指数的比较

注：与对照组比较**P＜ 0.01。 RVSP：右心室收缩压 mSAP：平均体循环动脉压 HR：心率 RV+dp/dtmax：右心室压力最大上升速率 RV-dp/dtmax：右心室压力最大下降速率 RVMI: 右心室肥大指数。1 mmHg=0.133 kPa

对照组 MCT 组RVSP (mmHg) 29.77±5.97 60.83±5.18**mSAP (mmHg) 105.63±6.92 107.80±5.41 HR (beats/min) 366.00±32.00 372.00±69.00 RV+dp/dtmax(mmHg/s) 706.04±74.77 2174.03±280.56**RV-dp/dtmax(mmHg/s) -650.66±106.46 -1541.83±343.50**RVMI (%) 28.45±3.27 47.91±9.54**

两组大鼠病理学改变：HE染色可见对照组大鼠右心室心肌细胞排列有序，胞核清晰 （图1A）。MCT组右心室心肌纤维粗大，细胞内肌原纤维数量增多，心肌纤维排列紊乱，细胞核深染，形状不整（图1B）。

图1 两组大鼠右心室心肌组织病理切片比较（苏木素伊红染色，×400）

两组大鼠右心室心肌组织TRPC6 mRNA表达的比较 ：MCT组右心室心肌组织TRPC6 mRNA表达（2.46±1.24） 较对照组（1.00±0.28） 升高，差异有统计学意义（P＜0.05， n=6）。图2

图2 实时定量RT－PCR检测大鼠右心室TRPC亚家族mRNA相对表达水平( n=6)

腹腔注射MCT 3周对右心室心肌组织TRPC6蛋白表达的影响：MCT组大鼠右心室TRPC6蛋白相对表达水平较对照组升高[ （2.02 ±0.47）vs（1.00±0.62）]，差异有统计学意义（P＜0.05，n=4）。图3

图3 蛋白质印迹法检测TRPC 6蛋白在大鼠右心室心肌组织的表达 ( n=4)

3 讨论

心肌肥厚是心脏的一种适应性变化，表现为心肌细胞体积和重量的增加，最终可导致心力衰竭甚至死亡，目前用于研究心肌肥厚的动物模型主要有异丙肾上腺素诱导法和腹主动脉缩窄法等诱导左心室心肌肥厚模型。因临床上肺源性心脏病非常常见，且缺乏有效的治疗手段，右心室是肺动脉高压预后的决定性因素，也是重要的治疗靶点[7]，故本文采用了MCT诱导右心室心肌肥厚模型。

本课题采用MCT给药3周的方式是借鉴了Tofovic 等[8]的研究结果，他们的研究发现MCT 诱导的大鼠肺动脉高压模型可以模拟人类原发性肺动脉高压症的发病过程。MCT属双稠吡咯啶生物碱，其进入动物体内后可在肝脏内经P450单氧化酶转化为有活性的野百合碱吡咯，可选择性地损伤肺动脉的内皮细胞，使内皮源性的一氧化氮合成及分泌减少，而增加释放了收缩血管的物质如：ET（内皮素）、PDGF（血小板源性生长因子）、bFGF（碱性成纤维细胞生长因子）等，引起肺动脉血管腔狭窄甚至堵塞及肺动脉血管收缩，同时由于内皮细胞坏死脱落容易启动内源性和外源性凝血途径，形成血栓，最终诱导致肺动脉高压[9]，本研究所采用的造模方法简单，可重复性好。

目前的很多研究都已经证实在大鼠肥大心肌细胞上能够检测到TRPC亚家族的表达，这与本研究的结果一致，其中TRPC6 mRNA 及蛋白的表达水平在MCT组中发生显著上调。目前已有研究表明TRPC6 通道在心肌肥厚中发挥了重要作用[10]。TRPC6是含有931个氨基酸的蛋白，它有六次跨膜的结构，其N端和C端均在胞内，它的第五和第六个跨膜结构区构成了非选择性阳离子通道[11]， 目前的研究发现TRPC6的作用机制与钠钙交换体相关联[12]。Kinoshita等[13]研究发现GC—A基因缺失后的小鼠，由于解除了GC—A对TRPC6的抑制作用引起了心脏中CaN／NFAT（钙调神经磷酸酶/激活T细胞核因子）信号通路的激活，从而导致了心肌肥厚。而本研究以不同的造模方式—MCT诱导，进一步证实了TPRC6通道的基因表达上调可能与心肌肥厚有关。

本研究以MCT诱导的大鼠右心室心肌肥厚模型进行研究，结果提示腹腔注射MCT3周可成功诱导大鼠形成右心室心肌增生肥厚，右心室收缩和舒张功能显著增加;表明MCT诱导3周能成功建立SD大鼠右心室肥厚模型，并增强了右心室心肌收缩和舒张的功能。 MCT组大鼠右心室心肌组织上的TRPC6 mRNA表达显著增加，在MCT注射后早期（第3天）TRPC6mRNA表达即出现显著增强，随后（第5天）达到一个平台期，并一直维持到3周，而其余TRPC亚型的mRNA表达水平无显著差异，在时间上亦无明显动态变化，MCT组大鼠TRPC6通道蛋白的表达显著增加，提示TRPC6可能参与了心肌肥厚的发生发展，TRPC6有可能成为治疗肺源性心脏病的新靶点。

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Effects of Monocrotaline on Right Ventricular Function and Expression of Cardiac Canonical Transient Receptor Potential Channels Subfamily in Experimental Rats

CAI Ke-Feng, CHEN Hui-Qin, XU Xun-Fa, LIN Wei-Qiang, XU Chao-Xiang, CHEN Guo-Zhen.
Department of Cardiology, The Second Aff i liated Hospital of Fujian Medical University, Quanzhou (362000), Fujian, China

CHEN Hui-Qin, Email: hollerry@163.com

Objective: To explore the effects of monocrotaline (MCT) on right ventricular function and expression of cardiac canonical transient receptor potential channels (TRPC) subfamily in experimental rats.Methods: The SD male rats were randomly divided into 2 groups: Control group, the rats were normally fed and MCT group, the rats received a single dose injection of MCT 60 mg/kg to induce myocardial hypertrophy. n=10 in each group and all animals were treated for 3 weeks. The right ventricular hemodynamics parameters and right ventricular hypertrophy index (RVHI) were measured, right ventricular myocardium tissue section was observed by HE staining, the mRNA and protein expressions of TRPC subfamily were examined by RT-PCR and Western blot analysis.Results: Compared with Control group, MCT group had increased RVSP, RVHI, RV+ dp/dtmaxand decreased RV-dp/ dtmax, all P＜0.01. In MCT group, the right ventricular myocardial cells had the thinker fi ber, deeply stained nuclei with irregular shape. Compared with Control group, the mRNA and protein expressions of right ventricular TRPC6 were elevated in MCT group, n=6 and n=4 respectively, all P＜0.05.Conclusion: Right ventricular hypertrophy could be induced by 3 weeks MCT treatment, it up-regulating the mRNA and protein expressions of TRPC6 which might be involved in the occurrence and development of cardiac hypertrophy inexperimental rats.

Monocrotaline; Canonical transient receptor potential channels; Cardiac hypertrophy; Ca2+

2014-04-30）

（编辑：曹洪红）

362000 福建省泉州市，福建医科大学附属第二医院 心内科（蔡克锋、徐训发、林伟强、许朝祥、陈国桢）；泉州医学高等专科学校基础医学部生理教研室（陈慧勤）

蔡克锋 主治医师 硕士 主要从事心血管临床及基础研究 Email: fjqzckf@yeah.net 通讯作者：陈慧勤 Email: hollerry@163.com

R541

A

1000-3614（2014）11-0928-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.11.019

方法：将20只SD雄性大鼠随机分为对照组（n=10）和野百合碱诱导右心室肥大模型组（MCT组，n=10 ）。MCT组以2% MCT 60 mg/kg 剂量一次性腹腔注射，建立MCT诱导的右心室肥厚大鼠模型。3周后，分别测定以上两组的右心室血流动力学参数和右心室肥大指数（RVMI），右心室心肌病理切片，并通过逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）和蛋白免疫印迹法（Western-blot）来检测信使核糖核酸（mRNA）和TRPC亚型的蛋白表达水平。

结果：MCT组与对照组比较， 右心室收缩压、RVMI显著升高，右心室内压力最大上升速率显著增加，右心室内压力最大下降速率显著下降，差异均有统计学意义（P＜0.01）；MCT组右心室心肌纤维增粗，细胞内肌原纤维数量增多，心肌纤维排列紊乱，细胞核深染，形状不整；MCT组较对照组右心室心肌组织TRPC6 mRNA表达升高，（n=6），右心室TRPC6蛋白相对表达水平升高（n=4 ），差异均有统计学意义（P＜0.05）。

结论：MCT预处理3周可诱导SD大鼠产生右心室心肌肥厚，上调了右心室心肌细胞TRPC6通道蛋白的mRNA和蛋白的表达，TRPC6可能参与了心肌肥厚的发生发展。