慢性心肌梗死大鼠室性心律失常的实验研究*

侯剑峰，张昌伟，郑哲，胡盛寿

基础与实验研究

慢性心肌梗死大鼠室性心律失常的实验研究*

侯剑峰，张昌伟，郑哲，胡盛寿

目的：证实大网膜是否通过逆转心脏神经重构降低心律失常易感性。

大网膜移植；心肌梗死；心律失常；神经重构

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:924.)

心肌梗死后以交感神经过度再生、交感神经和副交感神经平衡失调为特征的心脏神经重塑是心肌梗死后室性心律失常和心原性猝死的重要机制之一[1，2]。最近研究显示：传统冠心病再血管化技术—大网膜包裹术可以用于治疗神经系统损伤性和退行性疾病，如脑梗死、阿尔茨海默病及外周神经损伤等，并获得良好疗效。本研究旨在观察大网膜包裹术对心肌梗死后心律失常易感性的影响，并探讨其可能机制。

1 材料和方法

实验动物与方法：实验时间为2012-10至2013-07，实验动物：为SPF级Sprague-Dawley大鼠60只，均由北京市维通利华实验动物技术有限公司提供，6～8周龄，体重260～280g，雌雄各半。将大鼠随机分为3组，采用冠状动脉结扎法建立心肌梗死模型[3]完成第一次手术。3周后，使用超声心动图筛选大鼠心肌梗死模型[左心室短轴缩短率（LVFS）＜30%，左心室射血分数（LVEF）＜60%]，再完成第二次手术：①假手术组（n=20）：第一次缝线穿过冠状动脉下方而不结扎，4周后仅再次开胸；②单纯心肌梗死组（n=20）：第一次完成心肌梗死，4周后再次开胸，不移植大网膜；③大网膜移植组（n=20）：第一次完成心肌梗死，4周后再次开胸后，正中开腹将带蒂大网膜经过膈肌打孔移植至心肌梗死及周边区。

观察指标：程序性电刺激方法评估心肌梗死大鼠心律失常易感性[4]（评分法则：室性心动过速持续不超过15次被认为是非持续性，反之被认为是持续性。0分：未诱发心律失常；1分：三个期前收缩诱发非持续性心动过速；2分：三个期前收缩诱发持续性心动过速；3分：二个期前收缩诱发非持续性心动过速；4分：二个期前收缩诱发持续性心动过速；5分：一个期前收缩诱发非持续性心动过速；6分：一个期前收缩诱发持续性心动过速；7分：基础刺激能诱发心动过速；8分：未刺激时心脏即停跳）采用电生理方法评价各组大鼠的电生理特性，免疫组织化学方法检测心脏神经分布及密度，蛋白免疫印迹检测连接蛋白43（Connexin43）、神经生长因子（NGF）的表达，酶联免疫吸附法检测心肌组织内皮素-1（ET-1）的表达。

统计学分析：应用SPSS 13.0软件包进行统计学分析，计量数据采用表示，α=0.05为显著性检验水准，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

死亡率：每组20只大鼠纳入研究，假手术组第一次手术死亡1只，第二次开胸手术死亡1只，存活18只（90.0%）；单纯心肌梗死组第一次手术死亡2只，第二次开胸手术死亡1只，存活17只（85.0%）；大网膜移植组第一次手术死亡3只，二次开胸手术死亡3只，存活14只（70.0%）。

程序性电刺激方法检测各组大鼠室性心律失常的易感性结果：如图1所示：假手术组（n=18）未能诱发室性心律失常；单纯心肌梗死组（n=17）共13只（76.4%）大鼠诱发出室性心律失常，大网膜移植组（n=14）共6只（42.9%）大鼠诱发出室性心律失常；与单纯心肌梗死组相比，大网膜移植组心律失常评分显著下降（0.9±0.2 vs 3.5±1.2， P＜0.05）。与假手术组比较，单纯心肌梗死组与大网膜移植组心律失常评分显著升高（P＜0.05）。

图1 程序性电刺激诱发室性心律失常的易感性

自发状态下心肌梗死疤痕区域心表电位和同步兴奋阈值（通过心肌梗死区域的电刺激信号引起右心室流出道同步兴奋的最小刺激强度）：结果如图2所示：与单纯心肌梗死组相比，大网膜移植组自发状态下信号振幅显著升高[（3.4±0.3）mV vs（1.5±0.2）mV， P＜0.05]，其同步捕获阈值显著降低[（2.2±0.2）mV vs （ 5.5±0.3）mV，P＜0.05）。与假手术组比较，大网膜移植组及单纯心肌梗死组自发状态下信号振幅显著降低，其同步捕获阈值显著升高（P＜0.05）。

图2 自发状态下和刺激状态下心表电位

免疫组织化学方法对各组大鼠心脏神经密度评价：图3显示：在表示心脏交感神经的酪氨酸酶（TH）染色中，与单纯心肌梗死组比较，大网膜移植组新生神经密度显著下降[（1018.5±124.7）μm2/mm2vs （1552.4±270.3）μm2/mm2，P＜0.05]；表示心脏新生神经的神经生长相关蛋白-43（GAP43）染色中，与单纯心肌梗死组比较，大网膜移植组交感神经密度同样显著下降[（768.6±144.1）μm2/mm2vs （1388.4±244.9）μm2/mm2， P＜0.05]。与假手术组比较，大网膜移植组和单纯心肌梗死组新生神经密度和交感神经密度均显著升高（P＜0.05）。

Western blot结果：图4显示：与单纯心肌梗死组相比，大网膜移植组能显著提高Connexin43表达（P=0.037）；与假手术组比较，单纯心肌梗死组和大网膜移植组Connexin43表达显著降低（P＜0.05，图4A）。与单纯心肌梗死组相比，大网膜移植组心肌组织NGF表达水平显著降低（P=0.021）；与假手术组比较，单纯心肌梗死组和大网膜移植组心肌组织NGF表达水平显著升高（P＜0.05，图4B），ELISA结果显示：与单纯心肌梗死组相比，大网膜移植降低了ET-1的表达水平（P=0.033）；与假手术组比较，单纯心肌梗死组和大网膜移植组ET-1表达显著升高（P＜0.05，图4C）。

图3 免疫组织化学神经染色图及神经密度统计图

图4 三组Connexin43、NGF与ET-1表达变化

3 讨论

在本研究中，我们主要观察了大网膜移植对慢性心肌梗死大鼠心律失常易感性及其神经重构的影响。本研究的主要研究发现总结如下：①大网膜移植能改善慢性心肌梗死大鼠心脏电传导，降低其心律失常易感性；②大网膜移植能降低慢性心肌梗死大鼠心肌组织ET-1和NGF的表达，逆转心脏神经重构。

室性心律失常诱发的猝死是心肌梗死患者的主要死亡原因之一，在本研究中，我们证实大网膜移植能降低慢性心肌梗死大鼠的心律失常易感性，并且对其电生理机制进行了初步探索。折返形成是心肌梗死后室性心律失常的主要电生理机制之一，而局部的传导阻滞是折返形成的必备条件[5，6]。心肌梗死后纤维瘢痕的形成能构成结构性的传导阻滞，因此我们分别记录了自发状态下心肌梗死疤痕区域心表电位和同步兴奋阈值，研究发现大网膜移植后，心肌梗死瘢痕区心外膜自发电位明显增加而且同步电活动阈值明显下降，提示心肌梗死瘢痕区与正常心肌之间的电信号传导得到明显改善，这种改善会减少电信号的传导阻滞及由此导致的折返形成，进而减少室性心律失常的发生。Connexin43是介导心肌细胞之间的电信号传导最重要的缝隙连接蛋白，研究显示增加心肌梗死后Connexin43的表达能降低室性心律失常的发生[7]，而竞争性抑制Connexin43的功能则可以增加室性心律失常的发生[8，9]。我们的实验结果表明大网膜移植能增加慢性心肌梗死大鼠梗死周边区Connexin43的表达，因此我们推测大网膜能通过增加Connexin43的表达，改善心肌梗死局部心肌细胞之间电信号传导，加快电传导速度，进而减少折返以及室性心律失常的发生。

最近的研究表明心肌梗死后的心脏神经重构是室性心律失常发生的重要机制，因此，逆转心脏神经重构成为干预室性心律失常的途径之一[10]。我们的实验结果表明：心肌梗死后GAP43+的新生神经和TH+的交感神经在梗死周边区表达明显增加，提示该区域的神经过度再生，而且主要成分是交感神经，而大网膜包裹能够显著降低心肌梗死周边区GAP43+的新生神经和TH+的交感神经的表达，提示大网膜包裹可能通过逆转心脏神经重构降低了慢性心肌梗死大鼠心律失常易感性。

由于心肌梗死后的心脏神经再生过程与心脏组织局部的NGF表达呈正相关[11]。通过ET-1受体拮抗剂可以抑制心肌梗死后的心脏神经重构[12]。本实验结果显示大网膜移植降低了心肌组织ET-1以及NGF的表达水平，因此可以推测大网膜通过ET-1-NGF途径下调慢性心肌梗死大鼠梗死周边区交感神经密度，逆转了神经重构，进而降低了大鼠心律失常易感性。

本研究虽然证实了大网膜移植能通过ET-1-NGF通路逆转心肌梗死后的神经重构，并能通过改善心肌梗死心脏电信号传导，进而降低慢性心肌梗死大鼠室性心律失常易感性，但还存在不足之处：大鼠由于心脏体积过小，自发性心律失常的发生率较低，只能通过程序性电刺激诱发室性心律失常，这与临床现象并不完全符合，因此，需要开展大动物实验以进一步的证实大网膜移植降低室性心律失常的作用效应及其机制。

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Omentopexy Decreasing the Susceptibility of Ventricular Arrhythmia in Experimental Rats With Chronic Myocardial Infarction

HOU Jian-feng, ZHANG Chang-wei, ZHENG Zhe, HU Sheng-shou.
Department of Cardiac Surgery, Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital, CAMS and PUMC, Beijing (100037), China

HU Sheng-shou, Email: shengshouhu@yahoo.com

Objective: To conf i rm the omentopexy decreasing the susceptibility of ventricular arrhythmia in experimental rats with chronic myocardial infarction (MI) by nerve remodeling.Methods: The MI model of SD rats was established by left coronary artery ligation. 3 weeks later, the qualif i ed animals were randomized into 3 groups for the 2ndoperation.① Sham operation group, the rats received the 2ndoperation without ligation,② Isolated MI group, the rats received the 2ndoperation without omentopexy, ③ Omentopexy group, the rats received the 2ndoperation with omentopexy. n=20 in each group. 4 weeks after the 2ndoperation, the electrophysiological characteristics were assessed by relevant techniques, the new and sympathetic nerves in MI border zone were examined by immunohistochemistry, the protein expressions of connexin43 and nerve growth factor (NGF) were measured by western blot analysis and the cardiac endothelin-1 (ET-1) level was evaluated by ELISA.Results: Compared with Isolated MI group, Omentopexy group showed decreased susceptibility of arrhythmia (3.5 ± 1.2) vs (0.9 ± 0.2), improved electrical transduction (1.5 ± 0.2) mV vs (3.4 ± 0.3) mV and decreased capture threshold (5.5 ± 0.3) mV vs (2.2 ± 0.2) mV, all P＜0.05. Compared with Isolated MI group, immunihistochemisty indicated that Omentopexy group had decreased new and sympathetic nerves in MI border zone, as for GAP43: (1388.4 ± 244.9) μm2/mm2vs (768.6 ± 144.1) μm2/mm2, for TH: (1552.4 ± 270.3) μm2/mm2vs (1018.5 ± 124.7) μm2/mm2, all P＜0.05. Western blot analysis showed thatOmentopexy group had the lower NGF expression and higher connexin43 expression; ELISA demonstrated that Omentopexy group had the lower ET-1 expression, P＜0.05.Conclusion: Omentopexy may decrease the susceptibility of ventricular arrhythmia after MI in experimental rats, which might be related to the cardiac nerve remodeling.

Omentopexy; Myocardial infarction; Arrhythmia; Nerve remodeling

2014-08-04）

（编辑：汪碧蓉）

国家国际科技合作项目（2010DFA32620） 北京市科技新星计划（Z111107054511080） 协和青年科研基金项目（2013XHQN03）

100037 北京市，中国医学科学院 北京协和医学院 国家心血管病中心 阜外心血管病医院 心血管疾病国家重点实验室

侯剑峰 主治医师 博士 主要从事冠心病外科基础与临床研究 Email: hjf2006111@163.com 通讯作者：胡盛寿

Email: shengshouhu@yahoo.com

R54

A

1000-3614( 2014 ) 11-0924-04

10.3969/ j. issn. 1000-3614. 2014.11.018

方法：将大鼠随机分为3组：假手术组（n=20），单纯心肌梗死组（n=20）和大网膜移植组（n=20）。4周后分别采用电生理方法评价各组大鼠的电生理特性，免疫组织化学方法检测心脏神经分布及密度，蛋白免疫印迹检测连接蛋白43（Connexin43）、神经生长因子（NGF）的表达，酶联免疫吸附法检测心肌组织内皮素-1（ET-1）的表达。

结果： 与单纯心肌梗死组相比，大网膜移植组大鼠心律失常易感性显著下降（评分：0.9±0.2 vs 3.5±1.2，P＜0.05），电传导阻滞得到显著改善[信号振幅：（3.4±0.3）mV vs （1.5±0.2）mV， P＜0.05；捕获阈值：（2.2±0.2）mV vs （5.5±0.3）mV， P＜0.05]；免疫组织化学显示大网膜包裹显著降低了心肌梗死周边区新生神经以及交感神经密度[神经生长相关蛋白-43（GAP43）：（768.6±144.1）μm2/mm2vs （1388.4±244.9）μm2/mm2， P＜0.05；酪氨酸酶（TH）：（1018.5±124.7）μm2/mm2vs （1552.4±270.3）μm2/mm2， P＜0.05]；蛋白免疫印迹结果表明大网膜移植组NGF表达下调而Connexin43的表达上调，酶联免疫吸附法显示大网膜移植组ET-1的表达下调（P＜0.05）。

结论：大网膜包裹能减低慢性心肌梗死大鼠心律失常易感性，而且这种作用可能与心肌梗死后心脏神经重构的逆转有关。