Y染色体微缺失检测在男性不育的临床应用

卢丹洁 罗招云林芬 杨立业 林敏

·论著·

Y染色体微缺失检测在男性不育的临床应用

卢丹洁 罗招云★林芬 杨立业 林敏

目的探讨Y染色体微缺失检测与男性不育的相关性及临床意义。方法利用分布于AZFa、AZFb、AZFc、AZFd区15个Y染色体特异序列标签位点，以4组多重PCR技术对31例无精和165例严重少精患者及30例已婚自然生育男性自愿者进行Y染色体微缺失检测。结果196例无精症或严重少精症患者中，Y染色体微缺失14例，缺失率为7．14％（14／196），最常见Y染色体微缺失是AZFc+d。30例对照组没有发现任何缺失。其中AZFa区缺失4例（28．57％）和AZFc+d区缺失5例（35．72％），均表现为严重少精症；AZFb+c+d区缺失者4例（28．57％），1例为无精症，3例为严重少精症；AZFa+b+c+d区均缺失者1例（7．14％），表现为无精症。结论Y染色体微缺失是男性不育的重要病因，其检测为男性不育临床诊断和治疗提供科学依据。

Y染色体微缺失；男性不育；无精子因子；严重少精子症

男性不育是一种常见疾病，其中Y染色体微缺失是其中一个重要致病因素［1］。研究表明Y染色体长臂1区1带上含有与精子发生相关的基因，称为无精子因子（azoospermia factor，AZF），分为AZFa、AZFb、AZFc、AZFd四个区域，各区域内又包括若干AZF侯选基因，其中任何一个区域的微小缺失都能造成生精障碍导致无精子症或严重少精子症，使男性不育［1，2］。本研究采用四组多重PCR法对31例无精子症和165例严重少精子症的男性不育患者进行Y染色体微缺失检测，探讨Y染色体微缺失与男性不育之间的关系，为男性无精或少精的临床治疗提供重要依据。现报道如下。

1 对象与方法

1．1研究对象

在潮州市中心医院男科门诊以不育来就诊的196例患者（无精症为连续三次精液检测和睾丸穿刺检测均未发现精子；严重少精症为精子密度＜5× 106／ml，且排除了逆行射精，感染和抗精子抗体阳性等原因造成的不育），年龄20～46岁（平均年龄29．5岁），30例精子密度＞20×106／ml的正常生育男性为对照组。

1．2主要试剂和和仪器

DNA提取试剂盒和Y染色体微缺失基因检测试剂盒及Taq聚合酶、dNTP、DNA marker（深圳亚能生物技术有限公司）。标本制备过程严格按使用说明书在安全柜中进行操作。博日PCR基因扩增仪（TC-96）、电泳仪、紫外分析仪（WD-9403D型）。

1．3全血DNA提取

抽取患者2 ml外周抗凝血，严格按DNA提取试剂盒使用说明书进行操作，提取基因组DNA。

1．4Y染色体微缺失引物设计

引物由深圳亚能生物技术有限公司合成，共有15对引物和一对内控引物（SRY，472 bp），组成4套PCR多重系统。具体位点及相应区域见表1。

1．5PCR扩增

严格按Y染色体微缺失基因检测试剂盒使用说明书进行操作，运用四组多重PCR技术检测Y染色体AZF基因家族AZFa、AZFb、AZFc、AZFd四个座位上15个序列标签位点（STS）微缺失，4组多重PCR反应体系Ⅰ管、Ⅱ管、Ⅲ管、Ⅳ管，各反应扩增的STS位点及目的片段长度见表1。设置正常男性阳性对照、女性阴性对照、水为空白对照。PCR总反应体系25 μl在PCR仪上完成扩增反应。反应条件为：50℃10 min，95℃15 min；94℃30 s，58℃60 s，72℃60 s，35个循环；72℃10 min。PCR产物于4℃保存。

表1 正常男性Y染色体微缺失电泳检测对应表格Table 1The table of Y chromosome microdeletions were electrophoresised and detected in normal fertile men

1．6电泳检测

扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测。120 V电泳30 min，用MarkerI 100 bp DNA标志物为参照。取7 μl PCR产物加6×loading buffer 1 μl混匀后经2 g／dl琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察结果。记录电泳结果并拍照。扩增片段的结果判断：当PCR反应后的电泳结果在目的基因片段长度上有扩增显带出现，阳性对照正常显带，阴性对照未见显带，确认该基因位点存在；电泳结果未见扩增基因显带，而对照基因能正常显带，此时判定该基因位点缺失。

2 结果

实验结果有效的前提是阳性对照以正常男性基因组DNA为模板应扩增以下条带Y染色体基因微缺失，待测标本经PCR检测均能检出SRY和AZF基因特异性片段，表明所检测的DNA模板符合要求，整个扩增系统有效。30例健康生育男性均有基因扩增带。196例患者中，Y染色体微缺失14例，缺失率为7．14％（14／196），其中最常见的是AZFc+d区的基因位点缺失，未发现单独AZFb、AZFc、AZFd区及其它组合区模式缺失。AZFa区缺失4例（28．57％）和AZFc+d区缺失5例（35．72％），均表现为严重少精子症；AZFb+c+d区缺失者4例（28．57％），1例为无精子症，3例为严重少精子症；AZFa+b+c+d区均缺失者1例（7．14％），表现为无精子症。14例Y染色体微缺失情况见表2；1例AZFc+d区基因位点缺失和正常男性Y染色体微缺失凝胶电泳图，见图1。

表214 例Y染色体微缺失情况（n＝14）Table 2The result of 14 cases Y chromosome microdeletions（n＝14）

图1 AZFc+d区基因位点缺失和正常男性Y染色体微缺失凝胶电泳图Figure 1The figure of agarose electrophoresis of a case with AZFc+d microdeletions and Y chromosome microdeletions in normal fertile men

3 讨论

最近的研究提示［3］应用多重PCR方法对男性不育患者进行Y染色体微缺失的诊断方法已经成为国内外学者的共识。与悬浮阵列技术（suspension array technology，SAT）［4］相比，其特异性和敏感度相差无己。目前的文献报道中Y染色体微缺失频率为1％～55％［5］，这可能与方法学和研究对象及STS标记位点的密度和位置的选择标准及检测方法不同有关。本文参考欧洲男科学协会和欧洲分子遗传实验质控协作网实验室指南［3］发布的Y染色体微缺失分子诊断标准进行检测，应用四组多重PCR技术检测Y染色体AZF基因家族AZFa、AZFb、AZFc、AZFd四个座位上15个STS位点和1个内控位点。

男性不育症的正确诊断和治疗是全世界男科医学家经常面临的临床问题。据Bushnik报道［6］全世界普通人群男性不育症发病率约为10％～15％，不育的患者人数有逐年上升趋势。研究表明男性原发性不育是Y染色体上AZF区基因缺失引起［7，8］。因此Y染色体微缺失筛查对男性不育具有准确诊断、预后和预防重要价值，避免经验主义和昂贵治疗来提高生育力［2］。临床对无精子症及少精子症患者进行Y染色体微缺失检查非常必要，可查找男性不育的确切原因，避免不必要的药物治疗，又可避免无谓的外科手术治疗等，为行单精子卵胞浆内注射技术（ICSI）患者提供遗传信息参考，也可为优生优育提供可靠依据［9，10］。印度普通人群中男性不育平均为8．1％［11］；伊朗Totonchi报道［10］男性不育患者Y染色体AZF因子缺失率为5．06％（185／3 654）；Al-Achkar报道［12］的Y染色体AZF因子缺失率为28．4％（46／162）；无精子症患者AZF因子缺失率为10％～15％和少精子症患者AZF因子缺失率为5％～10％［13］。据Suganthi报道［9］男性不育患者总AZF因子缺失率为36％（18／50），其中无精子症患者12例和少精子症患者6例。本研究男性不育患者Y染色体微缺失率为7．14％（14／196），与上述文献报道的比较有些偏低，可能与本研究人群只经过简单筛选，要求无精症或严重少精子症（精子密度＜5×106／ml）才进行Y染色体微缺失检测，且无精症和严重少精子症的例数比与上述文献报道的少许多，也可能漏掉了AZFc区或AZFd及其它区部分基因位点缺失的样本，AZFc区或AZFd区基因位点缺失其精子密度是进行性下降，在年轻时精子密度往往＞20×106／ml。所以，Y染色体微缺失检测应延伸至所有精子密度减少的不育男性，并作为特发性和非特发性无精子症和少精子症的常规临床检查。本研究结果AZF缺失区域由高到低依次为AZFc+d、AZFb+c+d、AZFa、AZFa+b+c+d，发生率及发生区域与文献报道不同。如Ceylan报道［14］AZF缺失最常见类型是AZFc（34．8％），随后依次为AZFbc（15．21％）、AZFa（13．04％）、AZFac（8．7％）、AZFbc、AZFb、AZFd、AZFab、AZFad、AZFbd、AZFabc和AZFbcd。Totonchi也报道［10］AZF缺失最常见基因型是AZFc，其次分别是AZFb+c+d、AZFb+c、AZFb、AZFa和AZFa+c。

不同区域的AZF缺失可有不同的临床表现［2］，研究显示AZFa、AZFb、AZFc 3区全部缺失患者，100％表现为无精子症；AZFa区完全缺失或AZFb和AZFc两区同时缺失的患者96％表现为无精子症，4％表现为严重少精子症；AZFa或AZFb的部分缺失以及AZFc的部分或全缺失则有多种表现，从精子生成减少，少精子症和无精子症至唯支持细胞综合征（SCOS）等，AZF缺失范围大小与精子生成障碍表现程度有密切关系；AZFc区基因缺失的患者与精子数量减少密切相关［15］，AZFc区缺失的少精子症患者，其精子数目有进行性下降的趋势，部分患者最后发展为无精子症；AZFd微缺失患者为轻度少精或精子数目正常但精子形态异常。研究认为AZF因子缺失范围越广，睾丸生精功能越差。本研究结果与文献基本一致，所以AZF各区域缺失的类型与精液分析精子参数密切相关。如果整个AZFa区域缺失，主要表现为无精子，则不能进行ICSI。AZFc缺失者行ICSI受孕，这些患者的儿子都将是AZFc缺失的携带者［2］。

综上所述，本研究表明精子生成障碍与Y染色体微缺失之间有密切相关性，并对Y染色体微缺失患者进行分类研究，为男性不育临床诊治提供理论基础和指导。

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The clinical significance of Y chromosomal microdeletions detection in male infertility

LU Danjie，LUO Zhaoyun★，LIN Feng，YANG Liye，LIN Min
（The Medical Center，Affiliated Chaozhou Central Hospital，Nanfang Medical University，Guangdong，Chaozhou 521000，China）

ObjectiveTo assess the relevant relationship and clinical significance of Y chromosomal microdeletions and male infertility．MethodsY chromosome microdeletions were detected by 4 sets of multiple polymerase chain reactions from 196 male infertility patients with 31 cases azoospermia and 165 cases severe oligozoospermia and 30 normal fertile men．15 Y chromosome specific sequence-tagged site labels（STS）distributed in AZFa、AZFb、AZFc、AZFdwere amplified．ResultsOf the 196 cases with azoospermia or severe oligozoospermia，14 cases were found with Y chromosome microdeletions，given the prevalence rate of deletion was 7．14％（14／196）．AZFc+d were the most common deletions found in Y chromosome．No such deletion was observed among the 30 normal fertile men in the control group．A-mong those patients，4 cases（28．57％）with microdeletion in AZFa and 5 cases（35．72％）in AZFc+d regions，were all characterized with severe oligozoospermia；4 cases（28．57％）with Y chromosome microdeletions in AZFb+c+d，1 patient were characterized with azoospermia and the other 3 cases with severe oligozoospermia were detected．1 cases（7．14％）with highly microdeletion in AZFa+b+c+d regions were mainly characterized with azoospermia．ConclusionY chromosomal microdeletions is one of the major cause for male infertility．Analysis of them will provides science indication to diagnosis and therapy of male infertility．

Y chromosome microdeletion；Male infertility；Azoospermia factor（AZF）；Severe oligozoospermia

广东省卫生厅科研基金（A2012837）；潮州市科学技术局项目（2012SF24）

南方医科大学附属潮州中心医院检验实验中心，广东，广州521000

★通讯作者：罗招云，E-mail：1269299723＠qq．com