缺氧诱导因子及相关靶基因与卒中的关系研究进展

谌金花，罗永杰

缺氧诱导因子（HIF-1）是受控于氧浓度变化的一个至关重要的转录因子。在脑卒后HIF-1表达，与其下游靶基因的缺氧反应元件结合，调节其表达，介导机体的缺氧反应。本文对HIF-1及其重要靶基因（血管生长因子，热休克蛋白）在急性脑卒中的表达及临床意义进行综述。

1 HIF-1及其靶基因的结构

1.1 HIF-1 的结构 HIF-1 是一种DNA 结合蛋白，由α、β 两个亚基组成，以异源二聚体的形式存在，α亚基位于胞质中，其浓度水平随着低氧水平的增加而呈指数增加，β 亚基位于核中，其表达相对保持恒定。HIF-α家族包括三个成员：HIF-1α、HIF-2α（也叫做内皮PAS 区域蛋白-1,EPAS-1）和HIF-3α,后两者有更严格的组织表达。HIF-1α则为HIF-1所特有，既是HIF-1的调节亚基又是其活性亚基，其调节亚基包括两个重要的结构域:氧依赖降解结构域和C 末端转录激活结构域以及内在激活结构域［1］。

1.2 HIF-1相关靶基因的结构 HIF-1α表达后，与其下游靶基因的缺氧反应元件结合，调节其表达，介导机体的缺氧反应，在缺氧诱导的基因表达中发挥关键作用。目前已确认HIF途径直接激活超过70种基因,HIF 诱导的蛋白表达主要帮助缺氧细胞的代谢和生存需要。根据功能不同，这些靶基因分以下几类：（1）作用于血管舒缩的控制，如：肾上腺髓质素（AM）、一氧化氮合成酶（NOS）；（2）作用于血管的生成，如：内皮素1（ET1）、血管内皮生长因子（VEGF）、FLT1（VEGF受体1）；（3）作用于铁代谢,如：运铁蛋白受体、血浆铜蓝蛋白；（4）作用于红细胞生成，如：促红细胞生成素（EPO）；（5）作用于细胞分化/细胞循环控制，如：P21（WAF1/CIP1）、类胰岛素生长因子2（IGF2）I、GFBP1、IGFBP2、IGFBP3；（6）作用于细胞死亡，如：NIP3、NIX；（7）作用于能量代谢,如：葡萄糖载体1和3（GLU1、GLU3）、脯氨酰4 羟化酶a1、磷酸果糖激酶L乳酸脱氢酶A、醛缩酶A和C、丙酮酸盐激酶M、烯醇酶1、己糖激酶1和2、磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）；（8）作用于转录，如：DEC1 和ETS1、ID2、CITED2/p35srj；（9）作用于凋亡，如：NIP3、BNIP3、Noxa、Mcl1；（10）作用于应激，如：热休克蛋白70（HSP70）;（11）其他，如：纤溶酶原激活阻滞剂1（PAI1）、转换生长因子3（TGF3）、血红素加氧酶1、腺苷酸激酶3、磷酸甘油酸盐激酶1、碳脱水酶9、RTP801、PHD2、PHD3。其中血管内皮生长因子（VEGF）是一种多样多功能的生长因子，具有四大生物学特性：增加血管渗透性、促进血管生成、促进内皮细胞增值、保护神经细胞。而热休克蛋白70（HSP70）是一种在缺氧缺血等损伤后产生的具有高度保守性的应激蛋白，能使细胞对损害的耐受能力增强。综上所述二者在缺氧缺血损伤后，均具有保护作用。

VEGF是一种血管生长因子，在VEGF家族成员中VEGF是最强的调节血管生长因子。VEGF家族有以下几个成员：VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F和胎盘生长因子（PLGF）。它们虽然有相似的结构，但他们有着不同的生理和生物学特性，因为它们与三个特定的酪氨酸激酶受体（VEGF-R1、VEGF-R2和VEGF-R3）不同的相互作用决定的。

热休克蛋白根据不同的分子质量，分不同的家族：HSP100，HSP90，HSP70，HSP60，HSP40 和小HSP家族。其中最保守的是热休克蛋白70 家族［2］。有研究证实热休克蛋白存在于多种类型的细胞，包括神经元、神经胶质细胞和血管内皮细胞。热休克蛋白70由两个主要的功能区域组成：N-末端和C-末端结构。其N-末端的核苷酸结合域（NBD）为45 kDa，通过与未折叠蛋白和合成肽结合，可以刺激很弱的ATP酶活性；与底物结合的C-末端结构域（SBD），它进一步细分成β-夹心的为15 kDa的亚区和C-末端α-螺旋亚区。热休克蛋白在他们的促进者中有热休克元素，他们通过热休克转录因子（HSF，一个家族的转录因子）的结合和激活，在热冲击或压力后启动热休克转录［3］。HSF 通常与静息细胞中的热休克蛋白90 结合。在异常蛋白质的存在下，热休克蛋白90（Hsp90）与HSF解离，然后异常蛋白质结合从而被激活。一旦热休克蛋白70 被激活，在和其他的蛋白陪伴分子协同下，与变性蛋白结合，以防止蛋白质进一步的变性［4］。热休克蛋白在细胞缺氧缺血表达增加，它既是细胞受损的标志,又是神经保护因子,对神经细胞的损伤起着重要的保护作用。

2 HIF-1以及相关靶基因在缺血性卒中的表达及意义

2.1 脑缺血后HIF-1α的表达 HIF-1α在不同的脑损伤的实验模型以及不同的年龄中，其表达时间不一样。有实验发现HIF-1α在成年人的局灶性脑缺血后7.5h后表达［5］，而在成人全脑缺血模型中96h 后表达［6］。全身缺氧，不管其持续时间（1，3 或6h），大鼠大脑的HIF-1 核的含量增加［7］。心脏骤停复苏后1h 的大鼠大脑皮质，HIF-1 显著增加，持续升高超过12h［8］。更近的研究呈双相中风后，HIF-1的激活历时长达10d［9］。

2.2 脑缺血后HIF-1 以及相关靶基因表达 在脑缺氧和缺血时，通过转录活化缺氧诱导因子（HIF-1 和HIF-2）从而诱导血管内皮生长因子表达。有研究表明在局部缺血梗死3d 后，缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和血管内皮生长因子受体-2（VEGFR-2）的神经细胞在皮质区有表达，说明二者与梗死周围神经保护作用有关。在一个永久性局灶性脑缺血模型中，早在缺血发作后6h，VEGF 基因在半影区表达增加，导致在大脑中动脉闭塞后48 h 内缺血区域的新血管生长［10］。Ryu 等［11］的实验表明：血浆中的VEGF 在所有的卒中亚型（心源性卒中、大动脉粥样硬化性卒中、其它原因引发的卒中、小动脉闭塞性卒中和原因不明的卒中）中均增加，并且在所有卒中亚型中，VEGF 的增加持续表达3个月。VEGF对缺血性脑卒中的整体影响是复杂的，这可能与缺血的强度，持续的时间和侧支循环的建立有关。在缺血性脑血管疾病中，VEGF起到一种急性神经保护作用，作用于新的神经元的存活和新生血管的生长。这一点成为临床上潜在的应用点，我们可以通过多种机制，通过调节VEGF改善中风后的组织并且产生有用的功能。

热休克蛋白70 在各种大脑损伤后会产生，如缺血、缺氧、癫痫、外伤。内源性热休克蛋白70 在脑缺血后大约4～6h后表达和直到缺血后24h后缺血达高峰；与此相反，外源性缺血后21/4h 和3h 表达；有人假设在脑缺血的更早时间（如1～2h）给予重组热休克蛋白70，可以提供保护作用［12］。局灶性脑缺血后，HSP70 主要在梗死区域内的血管和小胶质细胞中和在梗死区域以外的神经胶质细胞和神经元中表达［13］。因此，在神经细胞中HSP70表达可以被看作一种定义半暗带的蛋白质变性的分子。

有研究发现在脑缺血中的梗死灶周围的散在神经胶质中存在HSP70 染色夹杂物［14］。这些热休克蛋白70染色的神经胶质夹杂物的形成可能依赖于脑缺血的严重程度和持续时间。在局部缺血后检测到两种有活性的小胶质细胞：有活性的HSP70阳性的小胶质细胞和有活性的HSP70 阴性的小胶质细胞［14］。而后者带有一种“极化的”和杆状的结构，可以促进梗死的形成，并代表有活性的小胶质细胞在梗死灶中迁移。在一些有活性的小胶质细胞中的HSP70 可能通过抑制炎症转录因子和细胞核因子-κB而抑制炎症。

2.3 脑缺血后HIF-1α表达意义 卒中后缺血性脑损伤是一个动态的过程，特别是在半影区，这个过程包括几个事件如氧化应激，细胞死亡，炎症，以及激活内源性的适应性和再生机制。许多这些进程发生在转录水平上的规例，涉及的协同激活各种转录因子，包括缺氧诱导因子（HIF）。虽然HIF-1的作用在缺血半暗带仍是未知，HIF-1 的活性和缺血半暗带区域之间有很强的相关性。在大脑中脑动脉闭塞后引起的短暂的局灶性脑缺血小鼠模型中，使用红外荧光标记的融合蛋白（POH-N）标记HIF 活跃的地区并成像［15］。结果表明，缺血性脑损伤后POH-N 标记的HIF 在体内具有监测作用和药物输送作用。

然而HIF-1 在缺血性脑病中的作用仍有争议。一方面，HIF-1 调节促进细胞适应低氧环境广泛的基因的表达。它的目标包括基因编码分子参与红血球生成，细胞增殖及能量代谢。这些功能可能有助于脑缺血神经元存活。神经元特异性敲除HIF-1α增加了组织的损伤和降低大脑中动脉闭塞的小鼠的成活率［9］。另一方面，一些研究报道了在脑缺血中的HIF-1相反的作用。Helton 等的研究结果证明消除大脑中的HIF-1能改善成年大鼠神经系统的细胞凋亡［16］。黄原酸盐通过抑制HIF-1α的表达以保护大脑的缺血损伤，抑制多余的血管内皮生长因子的表达，以避免血脑屏障破坏和通过BNIP3途径抑制神经细胞凋亡［17］。HIF-1α的siRNA通过抑制HIF-1α，及其下游的血管内皮生长因子和其它细胞凋亡相关蛋白如p53 和Caspase-3 在体内可保护缺血-再灌注损伤的神经元，并可能在治疗早期缺血性脑卒中具有潜力［18］。临床上有许多实验证明，抑制HIF-1α及其下游基因可减少脑梗死的出血性转换和改善局灶性脑缺血后神经功能缺损。总之，在缺血性神经细胞的结局中，HIF-1起着重要的作用。HIF-1参与细胞对缺血损害的反应，具有双刃剑效应。这的种效应可能取决于细胞损害的严重程度。了解这一机制有助于更好的理解其保护的积极作用和促进凋亡的消极作用，有助于引导我们去寻求如何应用其保护作用和减少其消极作用。

2.4 脑缺血后HIF-1α及其靶基因的表达的意义 VEGF的神经血管保护作用：（1）血管内皮生长因子的保护作用与抑制caspase-3活性有关，在外源性给予VEGF的治疗中和体内实验中，均表明VEGF通过抑制细胞死亡途径的执行而起保护作用；（2）VEGF 可作用于神经元微导管的内容物，在神经细胞的增长、稳定和成熟中起着重要作用［19］，从而对大脑的修复和重生起着重要的作用；（3）VEGF诱导NO从血管内皮细胞上释放以及通过轴索的生成和提高神经元的存活而直接起到神经保护效应［20］;（4）VEGF通过抑制谷氨酸和N-甲基-D-天门冬氨酸的毒性从而阻止海马神经元的死亡，以及通过删除VEGF启动子中的缺氧元反应元件导致大鼠的运动神经元的衰退［21］;（5）血管内皮生长因子已被当作一种促进神经发生的因子应用于成人大脑中，这种保护作用是其通过提供神经前体增值和分化的血管微环境而达到的，也通过促进内皮细胞释放脑源性神经营养因子而起作用，还作用于神经前体的有丝分裂。

Hsp70 蛋白在大脑缺血后的神经保护作用和以下几点有关：（1）可能部分与蛋白质的重折叠有关,在这个过程中HSP70 通过下游的细胞色素c 和上游的casase-3而起抗凋亡作用,通过保存能量的作用，避免损害线粒体的新陈代谢;热休克蛋白70 蛋白的N-末端部是必不可少的ATP-结合部，而C-末端的结合肽，是热休克蛋白70的抗凋亡部分［22］；（2）HSP70可能通过结合细胞凋亡诱导因子（AIF）和caspase-9的前体/抗恶性贫血因子（APAF），减少下游事件，而起保护作用［23］；（3）通过抑制蛋白质聚集从而减少细胞的凋亡和坏死，以及通过阻止NF-kB的活化以及与NF-kB相互作用的下游炎症因子的表达而减少炎症［24］。

3 HIF-1α在脑出血中的表达和意义

脑出血后引起的脑缺血症是可变的，往往是暂时的。在脑出血的血肿周围有一过性的血流量减少。即使低灌注可能不足以引起缺血性损伤，但缺氧仍可引起HIF-1α的表达。脑出血早期，血肿周边脑组织中HIF-1α蛋白表达的阳性率较低，此后逐渐增加。HIF-1α主要表达于神经细胞胞核，胞质中也有表达，其中胞核染色阳性的细胞多聚集在靠近血肿边缘的坏死区及血管相对稀少的区域，一般认为距离功能血管100～200μm以外区域即处于缺血环境中。Jiang 等［25］报道，脑出血造模后4h HIF-1α蛋白水平开始升高，第3d达到高峰，到第7d 时低于第1d 的水平，且第3d 的高峰期可以被水蛭素阻断。刘庆新等［26］研究高血压脑出血后4h血肿周围脑组织可见散在HIF-1α表达，24～48h 达到高峰，49～72hHIF-1α持续高表达。Zhu 等［27］发现，出血量＞60ml 的HIF-1α的表达，阳性率（88.9%）明显高于那些与出血量介乎30～45ml 或45～60ml（P ＜0.05）。

综上所述，HIF-1α的表达与出血的时间和出血的量密切相关。HIF-1α表达和血肿大小相关，这可能是血肿的占位效应、血液活性物质的释放、再灌注“无复流现象”、脑血流自动调节障碍等有关。随着出血时间的延长，血肿中的白细胞本身或刺激神经细胞产生的白细胞介素、肿瘤坏死因子α等可通过核因子κB途径上调HIF-1α的表达［28］和红细胞裂解物也可使HIF-1α的表达增加。干扰素α也可使HIF-1α转录增加。然而，缺氧以外的其他因素也有可能导致脑出血后HIF-1α上调。例如，凝血酶能诱导体外培养的平滑肌细HIF-1α上调［29］。

4 HIF-1以及相关靶基因对缺血后脑水肿的影响

卒中后脑水肿具有逐渐增加的发病率和死亡率，成为临床上关键问题。在脑缺血损伤后数小时内，早期的病理反应如血管通透性增加和脑水肿形成会被触发。有研究表明，VEG 在因血脑屏障破环导致的不同形式的脑损害的早期阶段，发挥了关键作用。在再灌注的大鼠大脑中动脉闭塞90min 后的大脑表面上，局部应用VEGF，明显减少梗死体积和水肿，以及降低了神经元的损伤［30］。另一方面，在缺血早期（1h）内全身使用VEGF，导致血脑屏障渗透性增加致急性脑水肿，同时增加了出血转化的风险［31］。局部组织VEGF 浓度精确地决定：新生血管是否发生，异常血管系统是否形成。这提示在正确的部位应用适量的血管内皮生长因子的重要性。全身的血管内皮生长因子的应用的有益效果，从另一方面来说是依赖于治疗的时间点。已有的数据表明，在正确时间和适量地应用VEGF 是至关重要的［32］。HIF-1α作为大脑的甘油浓度和脑水肿上游调节器，其分子途径涉及水通道蛋白（AQP-4 和AQP-9）,可以设想药理封锁这条途径可以为中风患者提供脑水肿新的治疗策略［32］。

5 HIF-1α与缺血性脑病的治疗

维生素E 诱导缺氧诱导因子-1α及其靶基因，包括血管内皮生长因子（VEGF）和血红素氧化酶-1的表达，从而减轻大脑缺血损害［33］。依达拉奉是一种新型的自由基清除剂，在临床上用于急性脑梗塞患者。研究表明，依达拉奉通过抑制HIF-1α信号通路诱导大鼠脑缺血再灌注损伤后的脑室管膜下区神经再生［34］。在动物实验的大脑中动脉闭塞导致的脑缺血中，葛根素是一种有效的神经保护剂。此效应可能是介导的，至少部分通过抑制HIF-1α和TNF-α的激活［35］。高压氧的预处理减少局灶性脑缺血后的脑损伤，这可能是通过上调HIF-1α及其靶基因EPO，从而减少神经元的缺血损伤以及凋亡［36］。Anan M 等［37］在HIF-1α，HIF-2α和环氧合酶2裸DNA诱导的大鼠血管生成的间接旁路模型中，用HIF-1α的DNA处理的10天组织学切片显示一个发达的侧支循环（P ＜0.05）以及梗死体积减少和对照的DNA 处理比较有统计学意义（P ＜0.01）。这些结果说明了通过HIF-1 的途径建立侧支循环来治疗脑缺血的一种新颖的方法的可能性，通过转录调控的策略来间接的促进新生血管的形成，改善卒中后局灶的缺血病变。

6 结语

HIF-1 及其相关靶基因是重要的转录调控因子,在缺氧缺血性脑血管疾病中和缺血性脑病的治疗中都扮演重要的角色。脑梗死或脑出血后病灶周围的缺血缺氧反应，诱导HIF-1 以及其相关靶基因的表达，从而直接或间接的起到保护作用，另一方面也产生一些负面作用。现目前关于HIF-1 以及其相关靶基因的研究，仍处于动物实验阶段，这提示我们在以后的临床试验中如何避免它们的消极作用更好的应用它们的积极作用是及其重要的。

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