云南半细毛羊毛囊干细胞微生物污染检测

吕春荣，李卫娟，权国波，洪琼花

（云南省畜牧兽医科学院，昆明 650224）

云南半细毛羊毛囊干细胞微生物污染检测

吕春荣，李卫娟，权国波，洪琼花

（云南省畜牧兽医科学院，昆明 650224）

为检测云南半细毛羊毛囊干细胞（hair follicle stem cells，HFSCs）是否受到微生物污染，为后续的诱导分化等研究奠定基础。用培养法检测细菌、真菌污染；利用荧光染色剂Hoechst33342检测支原体污染。结果表明：实验组细胞和阴性对照中均没有发现细菌污染，实验组中有25%的细胞受到霉菌污染；实验组细胞经Hoechst33342荧光染色后，仅细胞核显色，细胞表面及细胞周围干净、清晰，无荧光小点。说明云南半细毛羊HFSCs没有细菌、支原体污染，仅有25%细胞受到霉菌污染。霉菌孢子对环境的耐受力很强，普通的消毒液很难清除，所以对操作环境带来严重危害。

云南半细毛羊；HFSCs；污染

污染是细胞培养过程中长期面临的问题。物理、化学及生物因素都可能侵入培养环境对细胞造成污染。造成动物细胞培养体系污染的主要微生物是细菌、真菌、支原体等。入侵的微生物在培养体系中不断增殖、代谢。微生物代谢消耗大量必需的养分，同时产生多种有毒的代谢产物，进一步对细胞产生毒害作用［1］。

培养细胞作为一个生物体，会对培养环境以及环境中的污染物做出相应的反应，造成培养细胞生物学特性改变，而对实验结果造成潜在威胁，并随着污染时间的延长而增加，使研究结果的真实性和可靠性大大下降。American Type Culture Collection（ATCC）和日本理化研究所制订了标准化细胞系的细胞库细胞培养物的支原体污染的检测条例。中国科学院细胞库也把对支原体污染的检测作为最基本的质量控制。因此，对所培养细胞进行微生物污染检测尤为重要。本文对实验室所分离培养的云南半细毛羊HFSCs进行微生物污染检测，为以后有关云南半细毛羊HFSCs进一步的研究奠定坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 毛囊干细胞

来自于云南省畜牧兽医科学院草食家畜研究所2012年冷冻保存的不同代次的云南半细毛羊HFSCs 16支（第二代至第九代各2支为实验组）；细菌、真菌阴性对照：DMEM／F12培养基各2支；细菌、真菌阳性对照：将枯草芽孢杆菌和白假丝酵母菌分别接种到DMEM／F12培养基；支原体阳性对照：选取典型的支原体污染检测照片作为阳性对照。

1.2 方法

1.2.1 细菌、真菌检测

1）实验组：将复苏后的HFSCs细胞悬液接种到DMEM／F12培养基中，置于37.5℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养2周。

2）阳性对照组：将枯草芽孢杆菌和白假丝酵母菌分别接种到DMEM／F12培养基中，置于37.5℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养2周。

3）阴性对照组：DMEM／F12培养基各2支，置于37.5℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养2周。

1.2.2 支原体检测

1）阳性对照：选取典型的支原体污染检测照片作为阳性对照。

2）实验组：将被检HFSCs爬片在不含抗生素的培养液中培养2～3 d后，吸去培养液，用PBS漂洗，冷风吹干。用固定液固定细胞爬片15 min。然后将配制好的Hoechst33342工作染液滴加到固定好的细胞上，在室温下染色，30 min后用PBS浸洗染色后的盖玻片3次，每次3～5 min，冷风吹干。最后将含1%甘油的PBS加到染色后的细胞表面，将有细胞的盖玻片面朝下覆盖在载玻片上。封片处理完毕后晾干，用荧光显微镜观察细胞核周围是否有蓝色荧光小点或丝状点的荧光物产生。

2 结果与分析

2.1 细菌、真菌污染检测结果

HFSCs的培养基和阴性对照一样，没有混浊，倒置显微镜高倍镜下也没有观察到点状的细菌；实验组中有4支细胞在96 h后在细胞瓶壁可以见到明显的成片或是成块状的霉菌菌落，在倒置相差显微镜下能见到成树枝状生长的菌丝，如图1E所示。阳性对照均有明显微生物生长，在倒置镜下可见视野内布满点状的细菌颗粒，原来清晰的背景变得模糊，如图1A所示。成树枝状的霉菌如图1B所示。

2.2 支原体检测结果

阴性对照组和实验组细胞经Hoechst33342荧光染色后，仅细胞核显色，细胞表面及细胞周围干净、清晰，无荧光小点，如图1F所示。阳性对照组经Hoechst33342荧光染色后，可见细胞核与细胞膜及其周围均可见散在的蓝色荧光颗粒，如图1C所示。

图1 微生物污染检测

3 讨论

3.1 真菌污染

霉菌孢子对环境的耐受力很强，普通消毒液很难清除，所以对操作环境带来严重危害。37℃的培养温度已经超过霉菌最适生长温度（25℃左右），因而其生长速度更慢，一般培养96 h时肉眼才能观察到棉絮状的菌丝团等漂浮在培养液中［3］。霉菌污染后在低倍镜下可见乳白色的团状漂浮物，培养液无变化；高倍镜下可见明显的菌丝，细胞活力变差，生长速度明显变慢，甚至死亡［4］。

本实验对16支云南半细毛羊HFSCs进行真菌污染检测，有25%的细胞受到霉菌污染。霉菌污染率偏高，污染细胞集中在第四、五代细胞。这主要是受实验室培养环境及今年6、7月份云南降雨量较大、环境潮湿易发生霉菌污染所致。

3.2 支原体污染

细胞培养体系造成污染的微生物主要是细菌、真菌、支原体等，细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是很普遍的问题，做好支原体污染的防治工作，是保证实验顺利进行的重要一环。支原体污染，对体外培养的细胞几乎所有的指标及产物均有影响，而且可以不被察觉地随着细胞的传代而传代［5-9］。

支原体污染的来源包括：所使用动物来源的一些产品如血清或已被支原体污染的细胞株系。细胞培养上清液中支原体的浓度可达107个/mL，而培养的细胞看起来很正常，在肉眼观察或普通光学显微镜下观察，受污染的细胞可无明显变化［2］。体外培养的细胞被支原体污染后，几乎所有的指标及产物均受其影响，故有效地检测支原体污染是细胞实验成功的关键所在［10］。Chen［11］率先使用非特异性的DNA荧光染料Hoeehst33255，直接对可贴壁生长细胞培养物作DNA荧光染色，检测支原体污染，扩大了可被检出的支原体种类，缩短和简化了检测过程。其原理为：染色剂能透过胞膜完整的细胞，嵌入细胞核DNA中，结合到DNAA-T富含区域。而支原体A-T含量较高（55%～80%），亦能着色，在荧光显微镜下观察可看到蓝色荧光。因此，污染了支原体的细胞表面会有蓝色点状或丝状荧光［12］。所以可将其染色、检测。用荧光染色剂染色的细胞在荧光显微镜下观察，无支原体污染的细胞只有细胞核显色。而有支原体污染的细胞，在细胞核外与细胞核表面会出现蓝色荧光小点或丝状点，其形状一致，这与细胞残片染成不规则点状物不同。Hoechst作为荧光染色剂，从原理上来说都可以用于DNA荧光染色检测支原体污染，大多数学者用Hoechst33258来检测细胞支原体污染［13-15］。也有学者用Hoechst33342对细胞进行支原体检测［16］。这两种染色剂的不同点在于：后者对细胞的毒性作用更小一些，可以对活细胞直接进行染色。本实验通过Hoechst33342荧光染色检测支原体污染，仅细胞核显色，细胞表面及细胞周围干净、清晰，无荧光小点。说明所培养的云南半细毛羊HFSCs并未受到支原体污染。

除了用荧光染色法检测支原体以外，现在用得比较多的方法还有PCR法检测支原体：先采用酚氯仿法提取标本DNA，再从6种常见污染细胞的支原体16sRNA中选择2段高度保守的核酸序列作为引物，总长度为472 bp，引物A：5’-GGCGAATGGGTGAGTAACACG-3’，引物B：5’-CGGATAACGCTTGCGACCTATG-3’。利用建立的PCR反应体系和条件，对细胞进行扩增。琼脂糖凝胶电泳，紫外检测仪观察并用凝胶成像系统照相。此方法与DNA荧光染色法相比：敏感、特异性强，但价格比较昂贵。

微生物污染控制在一定程度上直接影响和反映一个国家的生物技术发展水平。所以，如何有效控制及预防微生物污染是广大科研工作者长期面临的巨大挑战和重要研究课题。

［1］李颖健，刘志红.细胞培养污染的途径、危害及预防措施［J］.肾脏病与透析肾移植杂志，1999，8（3）：245-249.

［2］刘玉琴.体外培养细胞工作中支原体污染及对策［J］.中华病理学杂志，2004，33（6）：571-572.

［3］曾卫东，董青.动物细胞培养中微生物污染的检测［J］.浙江畜牧兽医，2003（2）：12.

［4］田启超，张涛，田丽芳，等.细胞体外培养过程中霉菌污染的预防［J］.动物医学进展，2007，28（8）：115-116.

［5］Wirth M，Berthold E，Grashoff M，et al.Detection of mycoplasma contaminations by the polymerase chain reaction［J］.Cytotechnology，1994，16（2）：67-77.

［6］王正森，吴建新，赵小元，等.用PCR检测细胞培养中支原体污染［J］.生物化学与生物物理进展，1994，21（6）：553-556.

［7］Uphoff C C，Drexler H G.Detection of mycoplasma contaminations in cell cultures byPCR analysis［J］.HumCell，1999，12（4）：229-236.

［8］Uphoff C C，Drexler H G.Detecting mycoplasma contamination in cell cultures by polymerase chain reaction［J］.Methods Mol Med，2004，88：319-326.

［9］Wang H，Kong F，Jelfs P，et al.Simultaneous detection and identification of common cell culture contaminant and pathogenic mollicutes strains by reverse line blot hybridization［J］.Appl Environ Microbiol，2004，70（3）：1483-1486.

［10］Zinzendorf N Y，Kouassi-Agbessi B T，Lathro J S，et al.Ureaplasma urealyticum or mycoplasma hominis infections and semen quality of infertile men in Abidjan［J］.J ofReprod Contracept，2008，19（2）：65.

［11］Chen T R.In situ detection of mycoplasma contamination in cell culture by fluorescent Hoeschst-33258 stain［J］.Exp Cell Res，1977，104：255-262.

［12］Barile M E，Rottem S.Mycoplasmas in cell culture//I Kahane and A［M］.Adoni（ed.）.Rapid diagnosis of mycoplasmas.NewYork：Plenum Press，1993：155-193.

［13］刘谋渊，刘岚，赵娇，等.动物细胞培养中支原体污染的检测方法比较研究［J］.现代医药卫生，2011，27（5）：682-683.

［14］FreshneyR I.Culture ofanimal cells：A manual of basic technique［M］. 4th edn.NewYork：Wiley-Liss，2000：149-175.

［15］刘岚，陈绍坤，余红.贴壁细胞培养过程中支原体污染的几种救治方案疗效比较研究［J］.现代医药卫生，2008，24（8）：1221-1222.

［16］Wu S S，Li D J，Lv C R，et al.Establishment and cryopreservation of a skin fibroblast cell line derived from Yunnan semi-fine wool sheep in the presence of synthetic ICE Blocker［J］.Cryoletters，2013，34（5）：497-507.

Q813.1+1

A

2095-3887（2014）06-0046-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.06.013

2014-09-16

国家现代农业产业技术体系建设（CARS-40-06）；云南省应用基础研究青年项目（2012FD083）

吕春荣（1982-），女，助理研究员，硕士。

洪琼花（1968-），女，白族，研究员，硕士，主要从事绵羊、山羊的育种和高效繁殖新技术研究。