免疫不孕奶牛与健康奶牛宫颈黏液蛋白表达及初步分析

马梦婷，陈晓莉，王姗姗，高庆华，3，马 瑛

（1.新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，阿拉尔 843300；2.新疆塔里木大学生命科学学院，阿拉尔 843300；3.新疆塔里木大学动物科学学院，阿拉尔843300）

疾病防控

免疫不孕奶牛与健康奶牛宫颈黏液蛋白表达及初步分析

马梦婷1，2，陈晓莉1，王姗姗1，高庆华1，3，马 瑛1

（1.新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，阿拉尔 843300；2.新疆塔里木大学生命科学学院，阿拉尔 843300；3.新疆塔里木大学动物科学学院，阿拉尔843300）

为研究不孕与可孕奶牛间宫颈黏液蛋白质的差异，揭示奶牛宫颈黏液蛋白质与不孕的关系，采用二维凝胶电泳技术获得了不孕与可孕奶牛宫颈黏液中总蛋白的表达图谱，经过Ymension Revolutionary 2DGE Software自动匹配分析，得出不孕奶牛宫颈黏液蛋白质上样量分别为0.8 mg和1.6 mg时，蛋白质斑点数分别为134个和151个，检测出具有明显表达差异蛋白斑点数为17个。不孕与可孕奶牛宫颈黏液蛋白质上样量为1.6 mg时，蛋白质斑点数分别为151个和67个，有62个匹配的蛋白质斑点。证明不孕奶牛与可孕奶牛宫颈黏液蛋白中存在差异表达的蛋白斑点。该试验将有助于解释免疫性不孕奶牛宫颈黏液中的差异蛋白对生殖的影响，为改善诊断的特异性、治疗免疫性不育提供理论基础。

奶牛；宫颈黏液；双向电泳；差异蛋白

哺乳动物宫颈黏液（cervixmucus，CM）是宫颈内膜腺体的一种复杂分泌物，来自子宫内膜和输卵管分泌液和卵泡液，以及子宫、子宫颈上皮和白细胞碎片［1］。宫颈黏液的质与量受体内雌性激素水平的调节，在发情周期中呈现明显的规律性变化［2］。宫颈黏液是精子进入受精部位的重要通道，在正常受精过程中起栅栏作用，还起到保护、输送精子与保护宫腔的作用。但宫颈黏液也会由一些原因引起抗精子抗体（antisperm antibodies，ASA）滴度升高，而ASA是导致免疫不育的主要原因之一［3-4］，奶牛不孕症中15%～20%是ASA免疫不育，监测防控奶牛ASA免疫不育有重要的现实意义。在不孕症个体的血清、精液、宫颈黏液、阴道分泌液甚至卵泡液中都不同程度地存在ASA，但宫颈是ASA作用集中的部位，直接与精子作用，因此研究宫颈黏液ASA具有重要意义［5］。利用高分辨率、高重复性的双向电泳（two-dimension electrophoresis，2-DE）技术分析不孕与健康奶牛宫颈黏液中的差异蛋白［6］，建立宫颈黏液蛋白质组学数据库，可为进一步了解宫颈黏液蛋白对生殖过程的影响提供理论基础。

本实验拟通过二维凝胶电泳建立免疫不孕奶牛与健康奶牛宫颈黏液蛋白图谱，对蛋白质表达差异进行初步分析，筛选免疫不孕奶牛相关的新生物标记分子，为蛋白质水平研究奶牛免疫性不孕的发生机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

IPG胶条（ImmobilineTMDryStrip）购自GE Healthcare公司；尿素、硫脲、IPGBuffer、CHAPS、碘乙酰胺、Tris、SDS等购自Promega公司；硝酸银、硫代硫酸钠、无水碳酸钠、矿物油、二硫苏糖醇（DTT）和低熔点琼脂糖为Amresco公司产品；四甲基乙二胺（TEMED）、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸胺和甘油为Sigma公司产品；其余药品均为国产分析纯试剂。

IEF100等电聚焦仪，SE900垂直电泳仪及附件，Milli-Q超纯水仪，高速低温离心机（Sigma3K30型，德国），紫外分光光度计（T6型，北京），UMAX扫描仪，摇床（DSHZ-300A型），涡旋仪。

1.2 奶牛宫颈黏液标本采集

参试牛来自阿克苏五团牛场和呼图壁种牛场的7～8岁荷斯坦奶牛。以直肠检查和外部观察正常为基础，根据牛场配种生产记录和浅盘凝集检测［7］为参考资料，确定24头ASA阳性不孕奶牛和14头ASA阴性可孕奶牛。在奶牛发情盛期时直检刺激宫颈，待其流出宫颈黏液后，用注射器收集到事先灭菌的青霉素小瓶中，密封，-20℃保存备用。

1.3 宫颈黏液制备

参照文献［8］TCA-丙酮沉淀法制备宫颈黏液蛋白，并略作改进。取100 μL宫颈黏液样品，用-20℃预冷10% TCA-丙酮沉淀过夜，在4℃以12 000 g离心20 min，沉淀物用丙酮洗涤3次，自然晾干5 min。晾干后的宫颈黏液蛋白沉淀溶于约100 μL裂解液（7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4%CHAPS）。采用Bradford法测定蛋白浓度，根据定量结果调整上样量。

1.4 SDS-PAGE电泳分析

将定量后的蛋白质10 μL与样品缓冲液（0.5 mol/L Tris-HCl，10%SDS，5%巯基乙醇，20%甘油，0.2%溴酚蓝）按1:1混合，沸水煮沸5 min。SDS-PAGE采用Laemmli电泳缓冲体系，12.5%分离胶，4%浓缩胶，15 μL上样量，浓缩胶电压50 V，分离胶电压100 V，待溴酚蓝指示剂到达凝胶底部边缘时即停止电泳。电泳结束后采用银染，显色后经扫描仪扫描成像。

1.5 双向电泳分析

1.5.1 等电聚焦 将定量后的宫颈黏液蛋白样品与350 μL上样缓冲液（7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4% CHAPS，65 mmol/L DTT，0.2%IPG Buffer，0.001%溴酚蓝）均匀混合加入聚焦盘中，将胶条覆盖在样品之上，进行第一向等点聚焦。

1.5.2 SDS-PAGE电泳 等点聚焦结束后，将IPG胶条取出，分别用2%DTT、2.5%碘乙酰胺的平衡缓冲液依次平衡以还原和烷基化蛋白质，然后用12.5%SDS-PAGE凝胶进行第二向分离，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时停止电泳。取出凝胶，切角做记号。

1.5.3 蛋白质染色 凝胶染色采用银染的方法：固定20 min，银染1 h，显影5～15 min，中止显色10 min。

1.5.4 图像分析 用Dymension Revolutionary2D GE Software软件对银染后的凝胶图像进行背景消减、斑点检测、匹配等分析。

2 结果与分析

2.1 奶牛宫颈黏液总蛋白的SDS-PAGE电泳结果

用TCA-丙酮沉淀处理的奶牛宫颈黏液蛋白经SDS-PAGE电泳后可见，ASA阴性可孕奶牛和ASA阳性不孕奶牛宫颈黏液蛋白质存在很明显的差异（图1），而且各条带之间界限比较清晰，说明TCA-丙酮沉淀处理的奶牛宫颈黏液蛋白质经过SDS-PAGE电泳后能够得到较好的分离。与双向电泳相比，SDS-PAGE电泳可以反映出样品处理的效果，并能快速直观地表现总蛋白质的分布情况，为奶牛宫颈黏液蛋白质组双向电泳图谱的构建提供有效帮助。

图1 奶牛宫颈黏液经TCA-丙酮沉淀处理后SDS-PAGE电泳图谱

2.2 不同上样量双向电泳结果比较

不孕奶牛宫颈黏液蛋白上样量分别为0.8 mg和1.6 mg时，双向电泳结果表明，0.8 mg蛋白上样量较少，各个蛋白点较小，且不清晰（图2A）；而1.6 mg蛋白上样量各个蛋白点大而浓（图2B）。说明随着上样量的扩大，低丰度表达蛋白斑点数明显增加。以“斑点染色强度和面积3倍量的变化”为标准对蛋白表达图谱进行差异分析，检测出具有明显表达差异蛋白斑点数为17～21个，如图2B中圆圈内所示。

图2 不孕奶牛宫颈黏液蛋白质上样量为0.8 mg（A）和1.6 mg（B）双向电泳图谱

2.3 可孕和不孕奶牛宫颈黏液双向电泳结果比较

当可孕奶牛与不孕奶牛宫颈黏液蛋白上样量均为1.6 mg时，可孕奶牛宫颈黏液蛋白双向电泳图谱中获得蛋白斑点数为67个（图3A）；而在相同上样量的条件下，不孕奶牛宫颈黏液蛋白双向电泳图谱中获得蛋白斑点数为151个，经过软件匹配分析，匹配的蛋白质斑点数为62个，箭头所示为不孕奶牛宫颈黏液特异蛋白点（图3B）。

图3 可孕奶牛（A）和不孕奶牛（B）宫颈黏液蛋白上样量为1.6 mg的双向电泳图谱

3 讨论

通过双向电泳技术，对可孕奶牛与不孕奶牛的宫颈黏液建立2-DE图谱并进行初步差异蛋白分析，结果表明，不孕奶牛宫颈黏液蛋白随着上样量的扩大，低丰度表达蛋白斑点数明显增加，并且检测出具有明显表达差异蛋白斑点数17～21个。当可孕和不孕奶牛宫颈黏液蛋白上样量均为1.6 mg时，可孕奶牛宫颈黏液蛋白双向电泳图谱中获得蛋白斑点数67个；而在相同上样量条件下，不孕奶牛宫颈黏液蛋白双向电泳图谱中获得蛋白斑点数151个，经过软件匹配分析，匹配的蛋白质斑点数62个。实验获得较为满意的双向电泳图谱的关键是样品的处理和上样量的控制，哺乳动物组织液蛋白质制备方法比较多，利用TAC-丙酮沉淀法有利于得到更多、全面的蛋白质点，有利于得到更清晰、更全面的蛋白质图谱。该方法经历了沉淀—复溶的过程，可以简捷有效地去除杂质，同时能防止丢失碱性蛋白质，还能有效抑制蛋白酶活性，适用于不同蛋白质浓度的标本，不会特异地造成某些蛋白质的丢失，且可以通过略微增加沉淀的样品量来加以弥补［7-8］，加之沉淀过程在低温中进行，避免了蛋白质降解的弊端。实验所用银染法的灵敏度为考马斯亮蓝染色的10～100倍，能够更好地检测到一些低丰度表达蛋白。

ASA能够导致哺乳动物免疫性不育，在奶牛受精过程中，精子重复被注入到生殖道中［11］。各种原因的生殖道黏膜损伤、炎症和感染，都能使局部黏膜屏障作用减弱，生殖道局部黏膜的通透性增加，尤其是阴道黏膜局部pH值的改变［9］，使精子易被巨噬细胞摄取，精子抗原和精浆抗原经过生殖道局部时被免疫活性细胞识别，诱发局部或全身免疫应答，导致奶牛产生局部和全身的ASA。此外，生殖道中微生物所携带的抗原可能与精子抗原相同，从而发生交叉反应，因此抗微生物抗体的存在使ASA的发生率增高。在实验中通过对ASA阳性不孕奶牛和ASA阴性可孕奶牛宫颈黏液蛋白质2-DE图谱分析，发现二者存在明显的差异表达蛋白斑点，这些差异蛋白中存在ASA，在此基础上通过Western blot和质谱技术对这些差异蛋白斑点做进一步鉴定，将有助于从分子水平阐释免疫性不孕奶牛宫颈黏液中的差异蛋白对生殖的影响，为改善诊断的特异性、治疗免疫性不育提供理论基础，也可为发现新的药物治疗靶标和治疗方式提供依据。

［1］WHO.WHOlaboratorymanual for the examination ofhuman semen and semen-cervical mucus interaction［M］.2nd Edition.Cambridge：Cambridge UniversityPress，1987：26.

［2］Lin Ming，Lei Liang-yu，ZhangTing-hua，et al.Changes ofaminoacid content in cervix mucus of cowat the time pre-and post-ovulation［J］. Developmental&Reproductive Biology，2001，10：45-52.

［3］Naz R K.Modalitles for treatment of antisperm antibody mediated infertility：novel perspectives［J］.AIRI,2004，51（5）：390-397．［4］Bohring C，Krause W.The role of antisperm antibodies during fertilizationandforimmunologicalinfertility［J］.ChemImmunolAllergy，2005，88（1）：15-26．

［5］Waltraud Eggert-Kruse，Stefanie Bockem-Hellwig，Anette Doll，et al. Antisperm antibodies in cervical mucus in an unselected subfertile population［J］.Human Reproduction,1993，8（7）：1025-1031.

［6］States D J，Omenn G S，Blackwell T W，et al.Challenges in driving high-confidence protein identifications from data gathered by a HUPO plasma proteome collaborative study［J］.Nature Biotechnol，2006，24： 333-338.

［7］Jiang G L,He L，Fountoulakis M.Comparison of protein precipitation methods for sample preparation prior to proteomic analysis［J］.J Chromatogr A，2004，1023（2）：317-320.

［8］Gorg A，Weiss W，Dunn M J.Current two dimensional electrophoresis technologyfor proteomics［J］.Proteomics,2004，4（12）：3665-3685.

［9］Waltraud Eggert-Kruse，Isabel Botz，Sabine Pohl，et al.Antimicrobial activityofhuman cervical mucus［J］.Human Reproduction，2000，15（4）：778-784.

Preliminary Analysis on Proteome Maps of Cervix Mucus in Infertility and Healthy Dairy Cows

Ma Mengting1，2，Chen Xiaoli1，GaoQinghua1，3，et al
（1.KeyLaboratoryofTarimAnimal HusbandryScience and TechnologyofXinjiangProduction and Construction Groups，TarimUniversity，Alar 843300，China；2.College ofLife Science，TarimUniversity，Alar 843300，China；3.College ofAnimal Science，TarimUniversity，Alar 843300，China）

Tofurther explore the relationship between dairycows cervixmucus and the infecundityat protein level and analyze the expression changes ofproteins in cervixmucus offertile and infertile dairycows，the proteome expression profile of the fertile and infertile dairy cows’cervix mucus were obtained by 2D-PAGE.When the cervix mucus sample quantity were 0.8 mg and 1.6 mg，the number ofthe protein spot were 134 and 151 respectively，the differential protein expression was 17.When the fertile and infertile dairycows’cervixmucus sample quantitywere 1.6 mg，the number ofthe protein spot were 151 and 67 respectively，the number ofthe match protein spot was 62.The results indicated that there were significant differences in expression protein between fertile and infertile dairycows，and valuable information might be provided tofind newregulation markers ofmastitis and potential protein targets for treatment.

dairycow；cervixmucus；two-dimensional electrophoresis；differentiallyexpressed protein

S858.23

A

2095-3887（2014）06-0043-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.06.012

2014-09-12

国家自然科学基金（31060306）；新疆生产建设兵团畜牧重点实验室项目（HS20803）

马梦婷（1991-），硕士。

高庆华，教授，博士。