阿勒泰羊羔羊MSTN mRNA表达的发育性变化

吐来力江·哈木太，安外尔·热合曼，依明·苏来曼，决肯·阿尼瓦什

（新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐 830052）

阿勒泰羊羔羊MSTN mRNA表达的发育性变化

吐来力江·哈木太，安外尔·热合曼，依明·苏来曼，决肯·阿尼瓦什

（新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐 830052）

肌肉生长抑制素（MSTN）是一种骨骼肌生长发育的负调控因子。试验以不同生长阶段的阿勒泰羊羔羊为研究对象，采用实时荧光定量PCR技术测定了肌肉和脂肪组织中MSTN mRNA相对表达量。比较该基因在不同月龄阿勒泰羊羔羊肌肉和脂肪组织中的表达差异。结果表明：阿勒泰羊0～6月龄羔羊MSTN mRNA在肌肉和脂肪组织中均有表达。4月龄羔羊MSTN mRNA表达量在肌肉中最高，0～4月龄的表达量逐渐上升，4～6月龄逐渐下降。6月龄羔羊脂肪中的MSTN mRNA表达量最高。不同月龄阶段阿勒泰羊羔羊肌肉和脂肪MSTN mRNA表达量存在差异，这些差异可能会影响其生长发育和产肉性能等指标，这对进一步理解MSTN基因的调控作用奠定了基础。

阿勒泰羊；MSTN；肌肉；脂肪

阿勒泰羊是经过上千年独特自然条件选择和哈萨克牧民长期选育而成的新疆地方绵羊优良品种，主要产区在新疆北部阿勒泰地区的福海、富蕴、青河等地，分布在阿勒泰、布尔津、吉木乃及哈巴河等县［1］。在放牧条件下，该品种羊具备生长发育快、体型大、肉脂生产性能高、肌肉发达、羔羊生长发育快且早熟等特点［2］。

肌肉生长抑制素（MSTN）也称为生长分化因子GDF-8，是TGF-β超家族中的一员［3］。研究显示，MSTN基因除了对肌肉生长起负调控作用［4］外，还可影响脂肪组织的发育，最终导致脂肪积累的部分抑制［5］。Luc Grobet等［6］和 Alexandra C等［7］的研究显示，比利时蓝牛MSTN基因编码区末端11 bp的缺失导致了其肌肉过度肥大。McPherron等［5］报道MSTN基因的活性丧失可引起肌肉和体重增加，而脂肪不增加。对牛、猪、小鼠、人Myostatin基因表达进行研究，发现在胚胎发育期间MSTN表达量高，在出生以后，表达水平明显降低，但仍有少量表达。另外，Myostatin的表达主要在骨骼肌中，在脂肪组织、脑、心、小肠、肾、肝和乳腺等器官中也有表达［8-11］。吴舟等［12］采用MSTN RNAi双元表达载体对成肌

细胞增殖和分化进行了研究，发现双元表达载体能够促进成肌细胞大量增殖和成肌细胞向肌细胞分化及形成肌管，从而形成大量肌纤维。李达等［13］对湖羊MSTN基因表达的发育性变化的研究结果表明，MSTN在湖羊公母羊以及各月龄间大多存在显著或极显著差异。目前，国内外对MSTN基因的研究报道较多，这些研究大部分都集中在基因多态性方面，但针对阿勒泰羊MSTN基因表达规律的研究还未见报道。因此，本试验采用荧光定量PCR技术，通过荧光定量PCR 2-ΔΔCt方法［14］分析0～6月龄阿勒泰羊羔羊MSTN基因在肌肉和脂肪组织中的表达差异，深入了解MSTN基因在不同组织中的表达规律，为以后对阿勒泰羊MSTN基因以及该品种羊产肉性能分子机制的研究奠定理论依据。

1 材料与方法

1．1 材料

1.1.1 动物 从阿勒泰羊生产基地选择0～6月龄的阿勒泰羊羔羊10只。每月做手术从后腿肌肉组织和尾部脂肪组织中采集样品，分别装在冻存管中，迅速放入液氮罐中保存。

1.1.2 主要试剂 RNA提取试剂（Trizol Reagent）、反转录试剂（Reverse Transcriptase M-MLVRNase H-）、荧光定量试剂（Ribonuclease Inhibitor、SYBER PremixExTaqTM）等购自TaKaRa公司；琼脂糖、氯仿、异丙醇、无水乙醇、焦磷酸二乙酯（DEPC）等均由公司提供。

1.1.3 仪器 DYY-6C电泳仪，NanoDrop 2000c分光光度计，PCR仪（Biometra T），JY04S-3C型凝胶成像分析系统，Light Cycler 2.0实时荧光定量PCR仪。

1．2 方法

1.2.1 基因组总RNA的提取 按照Trizol试剂的说明提取阿勒泰羊肌肉和脂肪组织总RNA，分别吸取4 μL总RNA溶液，采用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测所提取的总RNA质量，同时利用分光光度计测定总RNA浓度,选出OD260/OD280比值达到1.7～2.0的RNA。总RNA溶液迅速置于超低温冰箱中（-80℃）保存。

1.2.2 反转录 调整所提取的总RNA浓度为2 μg，反转录体系为25 μL：模板RNA 2.5 μg，OligodT（18）1 μL，10×dNTP 1.5 μL，加RNase Free ddH2O10 μL后在普通PCR上70℃保温5 min后迅速冰急冷2 min以上，急冷后离心数秒加5×buffer 5 μL、inhibitor 0.1 μL、反转录酶0.5 μL、RNase Free ddH2O 9.4 μL后在PCR上42℃1 h、70℃15 min。

1.2.3 引物设计及合成 根据各基因在GenBank中的mRNA序列，利用primer premier 5.0引物设计软件设计引物。所设计的引物由上海生物公司合成。各基因的引物序列见表1。

表1 MSTN和β-actin基因的引物序列参数

1.2.4 MSTN基因mRNA表达的定量 利用普通PCR扩增MSTN基因，检测引物特异性。然后对肌肉组织和脂肪组织中MSTN mRNA进行相对定量分析。具体反应体系：RNase Free ddH2O 7.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，2× SYBR Premix EX Taq 10 μL，cDNA模板2.0 μL，共20 μL。MSTN反应条件：95.0℃10 s（预变性）；PCR：95.0℃5 s，60.0℃30 s，40个循环；95℃10 s；65.0～95.0℃升温0.5℃/s（PlateRead）。β-actin反应条件：95.0℃10 s（预变性）；95℃ 5 s，54.0℃ 30 s，40个循环；95℃10 s；65.0～95℃升温0.5℃/s（Plate Read）。以β-actin为对照，对MSTN mRNA表达水平进行校正。采用2-ΔΔCt法计算MSTN基因在不同组织的表达差异。

1.2.5 统计分析 先将10个个体不同阶段的表达数据作为重复度量变量来对待，利用SPSS统计分析软件的重复度量线性模型进行多元方差分析。

2 结果与分析

2．1 总RNA质量检测

利用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量，从图1中可见较清晰的28S、18S和5S RNA带，其中5S带较浅。经紫外分光光度计检测，A260/A280比值在1.7～2.0，表明RNA纯度和质量很好，可以进行后续的试验。

图1 总RNA的琼脂糖电泳检测

2．2 阿勒泰羊MSTN基因和β-actin基因的PCR扩增

在阿勒泰羊肌肉组织和脂肪组织中提取总RNA后，分别进行PCR扩增。采用2%琼脂糖凝胶分别电泳检测MSTN基因和β-actin基因扩增产物的质量。从图2可以

看出，可见引物可靠，可用于定量分析。

图2 PCR扩增结果（A、B分别代表MSTN、β-actin）

2.3 阿勒泰羊羔羊肌肉组织中MSTN mRNA的发育性变化

从表1可以看出，MSTN mRNA在0～6月龄阿勒泰羊羔羊肌肉组织中均有表达。其中4月龄羔羊MSTN mRNA表达量最高，0月龄羔羊的A表达量最低。4～5月龄羔羊肌肉组织中MSTN mRNA相对表达量显著高于0～3月龄（P<0.05）及6月龄羔羊（P＜0.05）。0～2月龄羔羊肌肉MSTN表达量无显著差异（P＞0.05）。0～4月龄羔羊肌肉MSTN的表达量具有逐渐上升的趋势，4～6月龄有下降趋势。

表1 0～6月龄阿勒泰羊羔羊肌肉组织MSTN mRNA相对表达量

2.4 阿勒泰羊羔羊脂肪组织中MSTN mRNA的发育性变化

经过定量发现，MSTN mRNA在阿勒泰羊0～6月龄羔羊脂肪组织中均有表达。从表2可以看出，0～6月龄羔羊脂肪组织中MSTN mRNA表达量呈上升趋势，0月龄羔羊MSTN mRNA表达最低，6月龄羔羊最高。0～2月龄羔羊脂肪中的表达量显著低于3～6月龄羔羊（P＜0.05）。

表2 0～6月龄阿勒泰羊羔羊脂肪组织MSTN mRNA相对表达量

3 讨论

MSTN基因对肌肉生长具有负调控作用的同时，还有影响脂肪形成等作用。国内对MSTN基因的研究主要集中在牛、猪两种动物身上，而且大部分集中在基因多态性方面。本试验通过定量0～6月龄阿勒泰羊羔羊肌肉组织和脂肪组织MSTN mRNA表达，发现0～6月龄现阿勒泰羊羔羊肌肉和脂肪组织中MSTN mRNA均有表达。其中4月龄羔羊MSTN mRNA表达量最高，0月龄羔羊的表达量最低；4～5月龄羔羊肌肉组织中MSTN mRNA相对表达量显著高于0～3月龄及6月龄羔羊（P＜0.05）；0～4月龄月龄的表达量具有逐渐上升趋势，4～6月龄表达量具有下降趋势。0～5月龄羔羊脂肪组织中MSTN mRNA表达量具有上升趋势，0月龄羔羊MSTN mRNA表达量最低，6月龄羔羊表达量最高；0～2月龄羔羊脂肪中的表达量显著低于3～6月龄羔羊（P＜0.05）。Ji等［9］的研究结果表明，在猪的整个生长期中，MSTN基因在骨骼肌中表达。白素英等［15］的研究显示，MSTN基因mRNA在骨骼肌和心肌中的表达量较高，平滑肌中表达量极弱。这些研究结果与本研究结果相符。梁婧娴等［16］报道，MSTN基因在腿肌中的表达量最高，在其他组织中几乎未表达。胡兰等［17］检测大骨鸡MSTN基因的表达，发现MSTN基因在骨骼肌中表达量水平较高，在心肌、肾脏、脑、肠、舌中也有微量表达，但在肺、肝脏中未检测出。从这些研究结果看，MSTN基因在各组织中有不同程度的表达。

本试验首次对不同生长阶段的阿勒泰羊羔羊肌肉和脂肪中MSTN基因的表达进行了初步研究，发现在每个阶段MSTN基因在肌肉和脂肪中均有不同程度的表达。这可能与MSTN基因特异性抑制肌肉生长和调节脂肪形成的功能有关。因此，按照MSTN基因在各阶段的表达特征，利用基因切除、抗体抗原等生物学方法控制阿勒泰羊羔羊肌肉生长和脂肪的形成，将有助于提高阿勒泰羊羔羊生长发育、肉质性状和生产性能。

［1］陶卫东，郑文新，高维明，等.阿勒泰羊肥羔生产产业化技术措施及市场前景分析［J］.新疆畜牧业，2007（2）：7-8.

［2］李金保，别克·木哈买提，库拉西，等.地方良种阿勒泰羊［J］.新疆畜牧业，2008（1）：31-33.

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Developmental Changes of Expression of MSTN mRNA in Altay Lambs at the Age of 0～6 Month

Tulailijiang·Hamutai，Anwaier·Reheman，Jueken·Aniwash，et al
（College ofAnimal Science，XinjiangAgricultural University，Urumqi 830052，China）

Myostatin is a negative regulater of skeletal muscle growth and development.In order to compare the expression of MSTN mRNA in the muscle and fat tissues of 0～6-month-old Altay lambs，the relative expression levels of MSTN mRNA of 10 Altaylambs were determined with the real time PCR technology.The results showed that the MSTN mRNAwere expressed both in the muscle and fat tissues；the expression level ofMSTN mRNAin the muscle ofthe lambs increased during0～4 month，decreased during 4～6 month，was the highest at 4th month;the expression level of MSTN mRNA in the fat tissue increased during 0～6 month，was the highest at 6th month.The expression differences of MSTN mRNA in the muscle and fat tissues might affected the growth and development，meat production and its quality.This study might lay a foundation for understanding the role of MSTN gene.

AltaySheep；MSTN；muscle；fat

S826．2

A

2095-3887（2014）03-0015-04

10．3969/j．issn．2095-3887．2014．03．004

2014-03-10

国家自然科学基金项目（31260530）

吐来力江·哈木太（1987-），男，哈萨克族，硕士研究生。

决肯·阿尼瓦什（1962-），男，哈萨克族，教授，博士。研究方向：动物遗传育种与繁殖。