吐鲁番黑羊MSTN/Smad信号通路基因表达的发育性变化

安外尔·热合曼，吐来力江·哈木太，马晓燕，依明·苏来曼，决肯·阿尼瓦什（新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐 830052）

吐鲁番黑羊MSTN/Smad信号通路基因表达的发育性变化

安外尔·热合曼，吐来力江·哈木太，马晓燕，依明·苏来曼，决肯·阿尼瓦什（新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐 830052）

为探讨MSTN/Smad信号通路基因对吐鲁番黑羊肌肉生长发育的影响，采用实时定量PCR法，分别对1～6月龄吐鲁番黑羊的腿肌和尾脂MSTN/Smad信号通路基因进行检测。结果表明：MSTN/Smad信号通路基因在腿肌和尾脂组织中均有表达，MSTN/Smad信号通路基因在吐鲁番黑羊不同生长阶段的腿肌和尾脂中的表达没有出现随月龄的增加而一直增加或下降的趋势。

吐鲁番黑羊；MSTN/Smad信号通路基因；基因表达；实时荧光定量PCR

吐鲁番黑羊主要生长在新疆吐鲁番地区的托克逊县，故又叫“托克逊黑羊”。吐鲁番黑羊头中等大，耳大下垂。公羊鼻梁隆起，具有较大的螺旋形角。母羊鼻梁稍有隆起，无角。颈中等长，额部有长毛，脸部有短毛。吐鲁番黑羊适应夏季40℃以上高温天气和冬季严寒、多风沙的吐鲁番盆地气候，能耐受粗纤维多、木质化强、多刺的耐盐碱、抗旱的牧草植物。吐鲁番黑羊在严酷的自然气候条件和粗放的饲管条件下，均能表现出生长发育快、四肢粗壮、早熟、肉味鲜美等特点，是当地农牧民重要的生产和生活资料，在当地畜牧业中占有相当重要的地位。

肌肉是动物胴体最重要的组成部分，是畜牧生产中的重要经济性状之一。因此，增加肌肉产量和提高肌肉品质一直是畜牧学家的主要研究目标之一。1997年英国霍普金斯大学Mcpherron等利用简并引物在小鼠身上偶然发现了肌肉生长抑制素（myostain，MSTN）基因。经蛋白质同源分析和核酸序列比对，证实其属于TGF-β超家族成员，故又称GDF-8［1］。MSTN基因编码一个25 kD的

二聚体的糖蛋白［2］。该糖蛋白在骨骼肌中广泛表达，其功能和表达量的变化可能会通过调节靶基因的表达而改变肌肉的纤维组成及造成肌肉重量的变化［3-4］。TGF-β家族成员主要是通过与细胞膜受体结合,将信号传递到下游分子Smad，磷酸化的Smda分子入核，调控相关基因的表达，从而发挥生物学效应［5］。

关于新疆地方绵羊品种mRNA水平基因表达的研究较少，已有的研究主要集中在对肌内脂肪相关基因的荧光定量方面。目前关于吐鲁番黑羊肉质性状形成的分子生物学基础，尤其是基因表达方面的研究还未见报道。因此，本文以吐鲁番黑羊为研究对象，利用相对定量RT-PCR技术，对1～6月龄吐鲁番黑羊的腿肌和尾脂组织中MSTN/Smad信号通路基因mRNA水平的发育性变化进行系统研究和比较分析，旨在为该羊的分子生物学研究及其开发利用提供参考。

1 材料与方法

1．1 材料

1.1.1 动物 试验羊均购自托克逊县地方国营牧场。选择饲养条件相同、生长发育良好、体重相近的1、2、3、4、5、6月龄吐鲁番黑羊各5只。屠宰后，取腿肌和尾脂等组织样品，冻存备用。

1.1.2 主要仪器设备 TGL-16M高速台式冷冻离心机为美国Thermo公司产品；SW-CJ-IF型超净工作台购自上海博讯公司；LightCycler2.0荧光定量PCR仪为Roche公司生产。

1.1.3 试剂盒及普通试剂 Trizol RNA提取试剂和反转录试剂盒、SYBR Green I荧光染料试剂盒、Taq酶、dNTP、DL2000、Marker等均购自TaKaRa公司，琼脂糖（AgroseH）、无水乙醇、DEPC等试剂均由北京鼎国生物有限公司提供。

1．2 方法

1.2.1 吐鲁番黑羊组织总RNA提取及cDNA合成 取液氮保存的各样本组织约100 mg。用Trizol法提取总RNA。分别吸取2 μL总RNA溶液，采用分光光度计测定浓度；采用2%琼脂糖凝胶电泳检测所提取的总RNA质量。检测完成后将总RNA溶液迅速置于超低温冰箱中（-80℃）保存。

1.2.2 引物设计及合成 参照GenBank公布的绵羊基因序列，采用Primer 5.0软件分别对MSTN、Smad2、Smad3、Smad4、TGFBR1、TGFBR2设计一对引物，由生工生物（上海）有限公司合成。6个基因的引物序列见表l。

1.2.3 cDNA的合成 提取的总RNA按照cDNA第一链合成试剂盒说明书反转录合成cDNA第一链。后-20℃保存。

表1 目的基因及内参基因引物序列

1.2.4 目的基因的定量 将合成的cDNA产物按荧光定量的要求做浓度稀释,使用ABI79（X）型荧光定量PCR仪对各组织中的MSTN/Smad信号通路基因和β-actin基因进行定量分析。具体反应体系：RNase Free ddH2O 9.4 μL，10 μmol/L上、下引物各1.0 μL。2×SYBR Premix EX Taq 10 μL，cDNA模板2.0 μL。MSTN反应条件：95℃10 s（预变性）；95℃5 s，60℃30 s，40个循环；95℃10 s；65～95℃升温0.5℃/s（Plate Read）。以β-actin为对照，对MSTN/Smad基因mRNA表达水平进行校正。

1.2.5 统计分析 Roche公司Light Cycler 2.0荧光定量PCR仪所得的循环阈值（Ct）数据应用Delta-Delta Ct方法进行相对定量分析,内参及目的基因的相对表达水平应用EXCEL软件进行统计分析。每个分析对象均取3次重复试验数据的平均值,每次试验用ddH2O为阴性对照。利用2-ΔΔCt方法计算表达量。

2 结果与分析

2．1 RNA纯度和完整性分析

提取的总RNA经2%琼脂糖凝胶电泳检测后可见较

清晰的28S、18S和5SRNA带。其中5S带较浅，表明RNA无明显降解（图1）。经分光光度计检测，A260/A280比值在1.8～2.0，表明RNA的纯度高，适宜进行定量分析。

图1 总RNA2%凝胶琼脂糖鉴定结果

2．2 MSTN/Smad信号通路基因mRNA相对表达量比较

从表2可见，1～6月龄吐鲁番黑羊的腿肌和尾脂在不同生长阶段之间MSTN/Smad表达存在显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）差异，每个月龄肌肉中的表达量明显高于对应月龄尾脂的表达量。MSTN基因在4月龄肌肉中的表达量最高；Smad4在5月龄肌肉中表达量最高，在6月龄尾脂中的表达量最低；Smad3的表达量无论是在腿肌还是尾脂中均比Smad2低。TGFBR2在1月龄腿肌中的表达量最高，在2月龄尾脂中的表达量最低。表明生长阶段对于MSTN/Smad信号通路基因在绵羊腿肌和尾脂组织中的表达具有重要影响。

表2 MSTN/Smad信号通路基因在吐鲁番黑羊不同月龄和组织中的表达

3 讨论

自从发现MSTN与肌肉生长发育特别是双肌臀形成有关后，关于MSTN的作用机制便成为研究的热点问题［6］。越来越多的研究结果显示，MSTN可能通过 TGFBR/Smad通路发挥作用。具体作用途径：MSTN首先在成肌细胞中合成前体蛋白，前体蛋白经过一次酶切后去除24个氨基酸的信号肽部分，接着在RSRR位点经过第2次酶切，产生了N-端和C-端片段［5］。C-端被切割后，片段之间通过二硫键相连形成二聚体，折叠成胱氨酸的结构［7］。研究发现，将不同浓度的外源性表达的MSTN蛋白质加入到C2C12成肌细胞的培养物中，随着MSTN浓度的增加，成肌细胞的繁殖速度相应减慢［8-9］。这表明，MSTN表达量的升高会造成肌肉生长速度的下降。在本研究中MSTN基因在4月龄吐鲁番黑羊腿肌中表达量最高，在6月龄尾脂中的表达量最低。Smad2基因在腿肌与尾脂中的表达量明显高于Smad3相应月龄的表达量。TGFBR2基因的表达量高于TGFBR1的表达量。结果表明：MSTN/Smad信号通路基因在吐鲁番黑羊中没有出现随月龄增加而一直升高或降低的趋势。

［1］Lee SJ，Mcpherron AC.Myostatin and the control of skeletal muscle mass［J］.Curropin Genet Dev，1999（9）：604-607.

［2］Zúniga J E，Groppe J C，Cui Y，et al.Assembly of TbetaRI：TbetaRII：TGFbeta ternary complex in vitro with receptor extracellular domains is cooperative and isoform-dependent［J］.J Mol Biol，Epub 2005，354（5）：1052-1068.

［3］DooleyS，Hamzavi J，BreitkopfK，et al.Smad7 prevents activation ofhepatic stellate cells and liver fibrosis in rats［J］.Gastro-enterology，2003，125：178-191.

［4］Guo X，Wang X F.Signaling cross-talk between TGF-β/BMP and other pathways［J］.Cell Res，2009，19（1）：71-88.

［5］Kambadur R，Sharma M，Smith T P L，et a1.Mutations in myostatin（GDF8）in double-muscled belgain blue and piedmontese cattle［J］. Cold SpringHarbor LaboratoryPress，1997（7）：910-915．

［6］甘尚权，刘守仁，王新华，等.MSTN基因在动物科学和医学中的研究进展［J］.草食家畜，2006（6）：131-132.

［7］张增荣，朱庆.肌肉生长抑制素（MSTN）基因的研究进展［J］.黑龙江畜牧兽医，2007（1）：19-21.

［8］孟详人，马月辉，叶绍辉.肌肉生长抑制素基因的研究进展［J］.家畜生态学报，2007（7）：28，4.

［9］张利媛，岳文斌.MSTN基因的研究进展［J］.草食家畜，2006（3）：1-4.

Developmental Changes of Expression of MSTN/Smad Signaling Pathway Genes in Turpan Black Sheep

Anwaier·Rehemam，Tulailijiang·Hamutai，Jueken·Aniwash，et al
（College ofAnimal Science，XinjiangAgricultural University，Urumqi 830052，China）

In order to explore the developmental changes of expression of MSTN/Smad signaling pathway genes on the muscle growth and development in Turpan black sheep duringthe age of1～6 months，the expression level of MSTN/Smad signaling pathway genes in the leg muscle and tail fat tissues were detected with Real time quantitative PCR.The results showed that the MSTN/Smad signaling pathway genes were expressed both in the leg muscle and tail fat tissues，but no continuous change trends were found.

Turpan black sheep；MSTN/Smad signalingpathwaygene；gene expression；Real-time PCR

S826．2

A

2095-3887（2014）03-0012-03

10．3969/j．issn．2095-3887．2014．03．003

2014-02-17

国家自然科学基金项目（31260530）

安外尔·热合曼（1986-），男，维吾尔族，硕士研究生。

决肯·阿尼瓦什（1962-），男，哈萨克族，教授，博士。研究方向：动物遗传育种与繁殖。