藏羊AMPK、ACC和GS酶活分布及饥饿应激对其酶活的影响

商振达，李长忠，毛学荣

（青海大学，西宁 810016）

繁殖与生理

藏羊AMPK、ACC和GS酶活分布及饥饿应激对其酶活的影响

商振达，李长忠，毛学荣

（青海大学，西宁 810016）

为分析AMPK等酶对机体代谢的影响，采用酶联免疫分析法（ELISA），分别测定正常饲养和饥饿48 h后藏羊各组织的AMPK、ACC和GS的活性。结果表明：AMPK、ACC和GS分布于藏系绵羊各组织中，且各组织器官中3种酶活性差异显著（P<0.05）；饥饿应激导致骨骼肌、肝脏、肾脏和小肠组织中AMPK活性升高，骨骼肌、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和小肠组织中ACC活性下降，骨骼肌、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和小肠组织中GS活性下降。因此，AMPK、ACC和GS在藏系绵羊的各组织器官中分布广泛；饥饿应激可能通过激活AMPK表达，下调ACC和GS表达而调节藏羊的应激代谢。

藏系绵羊；AMPK；ACC；GS；饥饿应激

藏羊在我国青藏高原及与其毗邻的川、滇、甘等高寒地区均有分布，是经过长期自然和人工选择形成的品种。由于生活环境的复杂性，藏系绵羊形成了体格大、体质结实、抗病力强、适应性好等的特点［1］。此外，藏羊肉具有高蛋白、高能量、低胆固醇的特点［2］。

一磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）是一种AMP激活蛋白激酶［3］，是由α、β和γ亚基组成的异源三聚体酶［4-5］，在动物应激过程中起重要作用［6］。乙酰辅酶A（ACC）属于生物素包含酶类型Ⅰ，催化脂肪酸的代谢途径中乙酰辅酶A生成丙二酸辅酶A这一关键步骤［7-9］。糖原合成酶（GS）是糖原合成关键酶，有磷酸化的非活性型糖原合成酶D和脱磷酸形成的活性型糖原合成酶两种形式［10］。AMPK、ACC以及GS间存在密切联系。AMPK可以通过磷酸化GS的Ser7和磷酸化ACC，使GS和ACC失活，从而抑制糖原和脂肪酸合成，降低ATP消耗，促进ATP生成［11-12］。因此，分析藏系绵羊体内AMPK、ACC和GS三种酶的酶活分布以及饥饿应激对宰AMPK、ACC和GS活性的影响，可为探讨AMPK活性变

化对ACC、GS活性的影响，从而为分析AMPK对机体代谢的机理提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 从青海省刚察县一屠宰场选取营养状况相同的6只藏羊，分成两组，即正常饲养和饥饿48 h的试验组，每组各3只。

1.1.2 样品采集与处理

1.1.2.1 组织的采集与处理 将藏羊屠宰后迅速取其骨骼肌、心肌、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和小肠组织，液氮保存（-180℃），以制备组织匀浆，提取酶液用。

1.1.2.2 组织匀浆的制备和酶液提取 参照Underwood等（2008）的方法，取冷冻的各组织器官，在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称取0.1～0.5 g磨碎，放入预冷的离心管中，加入0.5～2.5 mL冰的匀浆液匀浆（整个过程需要在冰浴中进行），然后在13 000 g、4℃下离心5 min，得到上清液置于-80℃冰箱中保存，用于AMPK、ACC和GS活性的测定。

匀浆液成分为：甘露醇0.25mol/L，Tris/HCl 0.05mol/L，EDTA 1 mmol/L，EGTA 1 mmol/L，DTT 1 mmol/L，NaF 50 mmol/L，焦磷酸钠5 mmol/L。

1.2 方法

1.2.1 AMPK活性测定 使用美国rapidbio公司生产的绵羊磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）酶联免疫分析试剂盒进行测定。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中绵羊磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶浓度。

1.2.2 ACC和GS活性测定方法 分别使用美国rapidbio公司生产的绵羊乙酰辅酶A羧化酶（ACC）酶联免疫分析试剂盒和绵羊糖原合成酶（GS）酶联免疫分析试剂盒进行测定。

1.2.3 数据处理 所有结果均以平均值±标准差表示。在进行正常藏羊各组织分析时，采用SPSS 17.0进行单因素方差分析，用Duncan氏法进行多重比较（P=0.05）。

2 结果与分析

2.1 正常生理条件下藏羊体内3种酶活分布

2.1.1 AMPK酶活 从表1可以看出，肺脏中AMPK活性最高，肾脏、脾脏和骨骼肌中AMPK活性较高，而心肌和小肠中的AMPK活性较低，肝脏中AMPK活性最低。各组织器官中AMPK活性总体差异显著（P<0.05）。

2.1.2 ACC酶活 从表1可见，肾脏和小肠中ACC活性最高，脾脏和肝脏中ACC活性较高，而骨骼肌和肺脏中ACC活性较低，心肌中ACC活性最低。各组织器官中ACC活性总体差异显著（P<0.05）。

2.1.3 GS酶活 从表1可见，肝脏和肾脏中GS活性最高，脾脏、骨骼肌和小肠中GS活性较高，而心肌中的GS活性较低，肺脏中GS活性最低。各组织器官中GS活性总体差异显著（P<0.05）。

表1 藏羊体内3种酶活分布

2.2 饥饿应激对藏羊各组织器官3种酶活的影响

2.2.1 AMPK酶活 由表2、表3可知，饥饿应激对藏系绵羊各组织器官AMPK酶活有不同程度的影响。与正常藏羊相应组织器官相比，饥饿应激对藏羊小肠AMPK活性影响最大，酶活升高了45.1%；其次是骨骼肌和肾脏，分别升高了23.4%和21.1%；对肝脏活性影响较小，只升高了14.3%；对心肌和脾脏AMPK活性无影响。而肺脏AMPK活性则下降。

2.2.2 ACC酶活 从表2、表3可见，与正常饲养藏羊相比，饥饿应激使藏羊肺脏ACC活性下降50.9%；其次是肾脏和骨骼肌，分别下降44.2%和43.4%；对小肠和肝脏ACC活性影响较小，分别下降22.5%和20.1%；对脾脏ACC活性影响最小，只下降17.1%；心肌ACC活性反而升高。

2.2.3 GS酶活 从表2、表3可见，肺脏和骨骼肌GS活性变化最大，饥饿应激使其分别下降73.8%和73.4%；其次是肝脏，下降37.6%；小肠和肾脏活性变化较小，分别下降21.9%和20.9%；脾脏GS活性变化最小，只下降10.0%，而心肌GS活性无变化。

表2 饥饿应激对藏羊各组织器官3种酶活影响

表3 与对照组相比AMPK、ACC和GS活性变化%

2.3 AMPK活性变化对相应组织器官ACC和GS活性的影响

分析结果显示，在骨骼肌、肝脏、肾脏和小肠中，饥饿应激引起AMPK活性变化与ACC和GS活性变化呈负相关。而在心肌、脾脏和肺脏中，3种酶活变化没有相关性。

3 讨论

AMPK、ACC、GS三种酶活是反映机体代谢的主要指标。余冰［13］研究结果表明，仔猪体内骨骼肌AMPK活性最高，肝脏中活性最低。秦玉辉［14］报道，蛋鸡体内骨骼肌和心肌中AMPK活性较高，肝脏中活性最低。本研究对藏羊体内酶活进行了测定，结果与余冰［13］对猪仔和秦玉辉［14］对蛋鸡的研究结果相似。藏羊各组织中肺脏、肾脏和脾脏中AMPK酶活最高，这可能与组织器官功能有关。肺脏呼吸时不停地收缩和舒张，肾脏排泄体内代谢废物，而脾脏过滤和储存血液，这些生理过程中均需要大量能量，导致AMPK不断被活化。饥饿应激使藏羊骨骼肌、肝脏、肾脏和小肠组织中的AMPK活性升高，肺脏AMPK活性下降，而对心肌和脾脏AMPK活性无显著影响，可能是机体适应饥饿的结果。

本研究发现藏羊肾脏ACC酶活最高，脾脏和肝脏ACC酶活较高，而心肌ACC酶活最低，这可能与组织结构和功能有关。肾脏的肾窦含有脂肪组织，脾脏是机体最大的免疫器官，含有大量淋巴细胞，而淋巴细胞具有运输脂肪的功能，而肝脏能将脂肪与磷酸及胆碱结合，转变成磷脂，转运到体内其他部位。饥饿应激使藏羊骨骼肌、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和小肠组织ACC活性下降，而使心肌ACC活性上升，均反映了藏羊对饥饿的适应性反应。

本研究还发现肝脏中GS活性最高，肾脏和脾脏GS活性较高，而肺脏中GS活性最低。这也许与各组织中糖原含量及与糖原合成不同有关。肝脏是机体内储存糖原的主要器官。饥饿应激使藏羊骨骼肌、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和小肠组织GS活性下降，而对心肌组织中GS活性没有显著影响，说明糖代谢对心脏功能的重要性。

综上所述，AMPK、ACC和GS三种酶在藏系绵羊体内广泛存在，饥饿应激使藏系绵羊体内的ATP含量下降，AMP含量升高，而AMP是AMPK的激活剂，因此饥饿应激会激活AMPK，而AMPK可以通过磷酸化作用，使ACC和GS失活，进而抑制糖原和脂肪酸的合成来阻止ATP的消耗。所以，动物可以通过AMPK活性的变化来调节机体的应激代谢。

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［14］秦玉辉.蛋鸡体内AMPK酶活分布及应激对AMPK酶活影响研究［D］.雅安：四川农业大学，2003.

Distribution of AMPK，ACC and GS Enzyme Activity and the Fast Effects in the Tibetan Sheep

Shang Zhen-da，Li Chang-zhong，MaoXue-rong
（Qinhai University，Xining 810016，China）

For analyzing the AMPK and other enzymes effect on metabolism，using enzyme-linked immunoassay（ELISA），the AMPK,ACCand GSactivityin everyorgans ofTibetan sheep after normal breedingand fast for 48 h were determined.The results showed that AMPK,ACC and GS distributed in every organs of Tibetan sheep,significant difference was found in three kinds of enzyme activity（P<0.05）；fast could increase AMPK activity in the skeletal muscle,liver,kidney and intestine tissues；decrease ACC activity in the skeletal muscle,liver,spleen,lung,kidney and intestine tissues；decrease GS activity in the skeletal muscle, liver,spleen,lung,kidneyand intestine tissues.So,AMPK,ACCand GSdistributed in the organs ofTibetan sheep extensively；fast might activate AMPKexpression and reduce ACCand GSexpression toadjust the stress metabolismofTibetan sheep.

Tibetan sheep；fast；AMPK；ACC；GS

S826.1

A

2095-3887（2014）01-0023-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.01.006

2013-11-04

国家科技部科技计划项目（2010-GA-870011）

商振达（1988-），男，硕士研究生。

毛学荣（1966-）。Email:mkymxr@163.com