鱿鱼肝脏活性肽的制备及生物活性研究

朱 瑶，胡建恩，杨 杰，卢 航，刘鹏宇，赵 慧

(大连海洋大学食品科学与工程学院，辽宁大连116023)

近年来，我国鱿鱼渔获量占总渔获量的比重呈不断上升的趋势。在加工过程中产生大量副产物，这部分肝脏大都用于加工鱼粉、鱿鱼浆等初级产品或直接丢弃，这不仅造成资源浪费还对环境造成污染。鱿鱼肝脏约占鱿鱼湿重的15%左右，其中约含19%的蛋白质［1］。目前对于鱿鱼肝脏的研究主要集中在脂肪和蛋白质方面，其中蛋白质主要是制备酱油等调味品和酶制剂［2-3］，对于活性肽的研究报道较为少见。笔者以鱿鱼肝脏蛋白为原料，通过酶解技术制备生物活性肽，并对其生物活性进行研究，以期为生物活性肽的制备提供新途径。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与试剂。鱿鱼内脏购于辽宁大连海洋渔业总公司;木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶，购于天津诺奥科技发展有限公司;胃蛋白酶，购于上海莲冠生物化学有限公司;α-葡萄糖苷酶、对硝基苯麦芽戊糖(pNPG)，购于Sigma公司;TT试剂、PT试剂、APTT试剂，购于上海太阳生物技术有限公司。

1.1.2 仪器与设备。Multiskan Ascent酶标仪，购于巩义市予华仪器有限责任公司;凝血仪为德国TECO产品;高效液相色谱为大连依利特科学仪器有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 肝脏基本营养成分的测定。将-18℃冷冻的鱿鱼内脏，于室温解冻，分离鱿鱼肝脏洗净后对其基本营养成分(水分、脂肪、蛋白质含量、灰分)进行测定。

1.2.2 鱿鱼肝脏蛋白质的制备及溶解度的测定。取鱿鱼肝脏与蒸馏水按1∶1.5(m/v)的比例捣碎制备鱿鱼肝脏匀浆液，于126℃ 、0.5 MPa条件下蒸煮20 min。将蒸煮液于5 000×g离心20 min，共得到4层物质。其中，最上层为油脂层，其余为蛋白质层，由上至下依次为样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。将得到的蛋白质烘干后粉碎，然后用丙酮进行少量多次脱脂处理，直至丙酮提取液颜色较浅为止。

称取样品 1 mg，分别溶于 10 ml pH 分别为 2、4、6、8、10和12的缓冲溶液中，充分混匀后取此浓度蛋白质溶液1 ml，采用Lowry法［4］测定样品中蛋白质含量，从而测定各蛋白质样品在不同pH条件下的溶解度，其计算公式为:蛋白质的溶解度=溶液中蛋白质的浓度×溶液总体积/样品的质量×100%。

1.3 鱿鱼肝脏生物活性肽的制备 选用酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶分别对鱿鱼肝脏蛋白进行酶解，酶解条件如表1所示。

表1 6种酶对鱿鱼肝脏蛋白的酶解条件

1.4 鱿鱼肝脏蛋白酶解液水解度的测定 采用甲醛电位滴定法测定溶液中游离氨基酸的数量，计算鱿鱼肝脏蛋白酶解液的水解度(DH)［5］。

1.4.1 完全水解液的制备。取鱿鱼肝脏蛋白139.94 mg(100 mg蛋白质)，放入反应瓶中加入6 mol/L的浓盐酸100 ml。将其密封后放入115℃的烘箱中消化24 h，水解完全后将水解液进行真空浓缩至0.5 ml。取一定量蒸馏水将其洗入烧杯中，用浓度为1 mol/L的NaOH溶液中和至中性(pH为6)，于100 ml容量瓶中定容至刻度线。

1.4.2 酶解液水解度的测定。取灭酶后的水解液8.0 ml，置于容量150 ml的三角瓶中，加入60 ml去CO2蒸馏水，调节pH至8.2。向烧瓶中加入10.0 ml中性甲醛溶液，混匀。用0.1 mol/L的NaOH标准溶液滴定至pH 9.2，记录此时消耗标准NaOH溶液的体积V1。以相同浓度未水解的鱿鱼肝脏蛋白溶液为空白，记录此时消耗标准NaOH溶液的体积V2。计算每克原料蛋白水解得到的游离氨基的毫摩尔数。

同样取完全水解液8.0 ml，利用甲醛电位滴定法重复以上操作。以相同浓度未水解的蛋白质溶液作为空白对照，分别记录二者消耗标准NaOH溶液的体积V3和V4，计算每克原料蛋白完全水解得到的游离氨基的毫摩尔数。

按照下式计算鱿鱼肝脏蛋白各酶解液的水解度:

1.5 鱿鱼肝脏蛋白酶解液生物活性的测定

1.5.1 抗凝血活性的测定。兔静脉采血后，立即将其与0.109 mol/ml柠檬酸钠抗凝剂按体积比9∶1于离心管中混匀，以2 000 g离心15 min，收集上清血浆，置于-70℃冰箱中保存，备用。

待测血浆中 V样品:V血浆为 1∶9，空白对照中 V生理盐水∶V血浆为1∶9。

1.5.1.1 凝血酶原时间(PT)的测定。在检测血浆中加入足量的凝血活酶和钙离子，测定血浆凝固所需的时间即为血浆凝血酶原时间(PT)。取25 μl待测血浆于37℃预热1 min后，加入50 μl预热的PT试剂(5 min≤预热时间≤15 min)，记录凝固时间即为PT值。以生理盐水作为空白对照，每个样品测定3组平行。

1.5.1.2 凝血酶时间(TT)的测定。待测血浆中加入“标准化”的凝血酶溶液后，血浆凝固所需要的时间为凝血酶时间(TT)。取50 μl待测血浆于37℃预热1 min，然后加入50 μl预热的TT试剂(5 min≤预热时间≤15 min)，记录凝固时间即为TT值。以生理盐水作为空白对照，每个样品测定3组平行。

1.5.1.3 活化部分凝血活酶时间(APTT)的测定。在37℃条件下用白陶土(激活剂)激活Ⅺ、Ⅻ因子。用脑磷脂(部分凝血活酶)代替血小板第3因子，测定乏血小板血浆加入Ca2+离子后凝固所需的时间即为APTT。该试验是内源性凝血系统灵敏和常用的筛检试验。取25 μl待测血浆和25 μl APTT试剂混合，37℃预热 5 min，然后加入 25 μl 0.025 mol/ml预热的CaCl2溶液。记录凝固时间即为APTT值，以生理盐水作为空白对照。每个样品测定3组平行。

1.5.2 ACE抑制活性的测定。取5 μl样品与15 μl ACE混合后于37℃条件下预热5 min，加入25 μl 7.6 mmol/L的底物 HHL(底物溶解于608 mmol/L NaCl，pH 8.3、0.1 mol/L 硼酸缓冲液)中启动反应体系，37℃水浴条件下反应25 min，再加入10 μl的10%三氟乙酸终止反应后，用反相高效液相色谱法在波长228 nm条件下测定马尿酸的含量，以未加样品为空白对照，按照以下公式计算ACE活性抑制率:

1.5.3 抗氧化能力的测定。

1.5.3.1 还原力测定。根据Dike Teng等［6］测定还原力的方法稍作修改，对样品的还原力进行测定。取1 ml样品与1 ml 0.2 mol/L pH 6.6的磷酸盐缓冲液混匀，然后加入1 ml 0.1%的铁氰化钾，在50℃条件下反应20 min后，急速冷却，以1 ml 10%的TFA终止反应。取2 ml此反应液加入2 ml蒸馏水及0.8 ml 0.1%FeCl3混匀，10 min后测定混合液在波长700 nm处吸光值。以1 ml蒸馏水为空白对照，以90 μg/ml VC为阳性对照，按照以下公式计算羟自由基清除率:

1.5.3.2 羟自由基清除能力的测定。参照Fenton反应方法建立反应体系模型［7］。取1 ml 9 mmol/L FeSO4溶液、1 ml 9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液及1 ml 5 mg/ml样品溶液于试管中混匀，再加入0.8 ml 8.8 mmol/L H2O2启动反应，将混合液于37℃反应30 min。以蒸馏水代替样品为空白对照，以蒸馏水代替H2O2为背景影响，同时以蒸馏水作为参比，测定反应液在波长510 nm处的吸光值，以250 μg/ml VC作为阳性对照，按照以下公式计算羟自由基清除率:

羟自由基清除率(%)=1-(AS-A0)/Ac×100%

式中，AS为样品反应吸光值，A0为样品背景吸光值，Ac为空白对照吸光值。

2 结果与分析

2.1 鱿鱼肝脏基本营养成分的测定结果 采用国标对鱿鱼肝脏基本营养成分进行了测定。由表2可知，鱿鱼肝脏中蛋白质占湿重的17.42%，占干重的33.74%。脂肪占湿重的32.56%，占干重63.06%。

表2 鱿鱼肝脏基本营养成分的测定结果

2.2 鱿鱼肝脏蛋白质溶解度 鱿鱼肝脏经高温蒸煮离心后得到4层物质，自上而下依次为油脂、悬浮层、溶液层、沉淀层。将3个蛋白质样品分别于烘箱中烘干后，加入丙酮进行脱脂处理。将脱脂后的3个蛋白质样品分别溶解于pH为2、4、6、8、10 和12 溶液中，并测定溶解度。试验发现，溶液层样品在各pH条件下的溶解度均高于其他样品，在pH为10条件下溶解度最大，因此选用溶液层蛋白质为原料制备生物活性肽。

2.3 鱿鱼肝脏蛋白6种酶解液的水解度 采用甲醛定位法测定了6种蛋白酶解液的水解度。从图1可以看出，中性蛋白酶酶解液最大水解度为13%。

图1 6种蛋白酶解液的水解度

2.4 鱿鱼肝脏蛋白酶解液生物活性

2.4.1 抗凝血活性。分别测定了6种酶解液的抗凝血活性。结果表明，中性蛋白酶解液对凝血过程中的内源途径和共同途径作用最强，APTT值为59.8 s，TT值为34.2 s，较空白对照分别延长26.7和20.6 s。对于外源凝血途径(PT值)，各酶解液的作用均不明显。阳性对照肝素钠的各值均超过了凝血仪的测定范围(0～300 s)。

2.4.2 ACE抑制活性。鱿鱼肝脏经6种蛋白酶水解后，对ACE均有较强的抑制活性，其中中性蛋白酶解液和碱性蛋白酶解液的抑制率较高，分别为68.0%和63.4%。

2.4.3 抗氧化活性。分别测定了6种酶解液的抗氧化活性。结果表明，酸性蛋白酶和胃蛋白酶的水解液还原力最强，其OD700与VC(1.04)相当，分别为0.96和1.00。酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶酶解液的羟自由基清除能力较好，分别为91.4%、92.2%和93.6%。且高于阳性对照VC(71.1%)。

3 讨论

我国海洋生物种类多、资源丰富，在其生长和代谢过程中生产各种具有特殊生理功能的活性物质，为开发研究活性化合物奠定基础。

该试验以鱿鱼肝脏为原料，通过酶解技术制备生物活性肽并测定其活性，得到6种酶解液中中性蛋白酶解液的抗凝血活性和ACE抑制活性最强;碱性蛋白酶也具有较强的ACE抑制活性;酸性蛋白酶和胃蛋白酶均具有较强的抗氧化活性。笔者从鱿鱼肝脏中制备生物活性肽并对其活性进行初步研究，为今后进一步分离纯化及活性研究提供理论基础，以期提高鱿鱼肝脏的综合利用效率。

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［5］新淮，冯志彪.蛋白质水解物水解度的测定［J］.食品科学，1994(11):65-67.

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［7］丁利君，周圳辉，林燕如.芒萁中黄铜物质的提取及抗氧化研究［J］.食品科技，2005，26(8):77-79.