高压液相色谱-质谱法和高效液相色谱法分析籽瓜中环磷酸腺苷

席冬华，高 晶，彭新媛，王 倩，李 玲，吴 斌,*

（1.新疆大学化学化工学院，新疆 乌鲁木齐 830046；2.新疆大学理化测试中心，新疆 乌鲁木齐 830046；3.新疆农业科学院农产品贮藏加工研 究所，新疆 乌鲁木齐 830091）

高压液相色谱-质谱法和高效液相色谱法分析籽瓜中环磷酸腺苷

席冬华1，高 晶2，彭新媛1，王 倩3，李 玲1，吴 斌3,*

（1.新疆大学化学化工学院，新疆 乌鲁木齐 830046；2.新疆大学理化测试中心，新疆 乌鲁木齐 830046；3.新疆农业科学院农产品贮藏加工研 究所，新疆 乌鲁木齐 830091）

采用高压液相色谱-质谱法鉴定籽瓜中的环磷酸腺苷，并建立高效液相色谱法测定籽瓜 中环磷酸腺苷的含量，对样品提取条件进行优化。结果表明：环磷酸腺苷在0.1～100 mg/L质量浓度范围内线性关系良好，相关系数为0.999 9；平均加标回收率为98.40%，相对标准偏差为3.22%。经单因素试验和正交试验，确定优化的提取条件为料液比1∶12（鲜样）和1∶60（干样）水提取，提取温度90 ℃、提取时间40 min、提取次数3 次。样品前处理和分析方法准确、简便、可靠、重复性好，可用于籽瓜中环磷酸腺苷含量的分析测定。

籽瓜；环磷酸腺苷；高压液相色谱-质谱法；高效液相色谱法

环磷酸腺苷（cyclic adenosine-3’,5’-monophosphate，cAMP）是核苷酸的衍生物，蛋白激酶致活剂，被称为“生命第二信使”（激素为第一信使），广泛存在有机体中的一种具有生理活性的重要物质。医学研究证明有40多种疾病与cAMP的代谢有关，包括癌症、高血压、冠心病、心肌梗塞和心源性休克[1]和帕金森综合症[2]等重大疾病。cAMP可以通过化学合成、微生物发酵、天然产物分离提取等方法获得。化学合成cAMP的方法[3]存在化学试剂不能完全去除的隐患和环境危害；微生物发酵cAMP方法培养周期长，产物中可能含有菌体代谢产物[4]；而天然产物提取的cAMP具有绿色，无毒副作用等特点，具有较高的商业开发价值，从富含cAMP的植物源组织中分离检 测cAMP是当今研究热点之一[5]。

目前，分析cAMP的方法主要有纸色谱法、薄层色

谱法[6]、竞争结合蛋白分析法[7]、高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法[8-9]、液相色谱-质谱（liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry，LC-MS-MS）法[10-12]、亲水色谱-二极管阵列检测器-电喷雾四极杆飞行时间质谱法[13]等。高效液相色谱法具有分析时间短、分离度好、灵敏度高、操作简便的特点，近几年来得到迅速发展[14]与广泛应用。已有大量文献报道用HPLC法测定不同地区[15-16]、不同品种枣果[17-20]中的cAMP含量，但对籽瓜瓜皮和瓜瓤中cAMP的研究报道很少。

籽瓜（又称打瓜）是葫芦科西瓜属普通西瓜的栽培变种，极具地域特色，中国籽瓜种植面积和产量均居世界之首，新疆是我国籽瓜主产区之一。目前，对籽瓜的利用只是做到了取籽加工，瓜籽只占鲜瓜质量的3%～5%，其余约占瓜质量95%以上的部分都作为废物而被丢弃[21]，造成极大的资源浪费。本实验通过建立检测籽瓜中cAMP含量的HPLC法，为籽瓜资源的深加工提供技术支持，也为植物源cAMP的研究与应用提供新的原料来源。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

籽瓜（品种：黑大片） 新疆昌吉垦区；cAMP标准品（纯度≥99%） 北京百灵威化学技术有限公司；甲醇（色谱纯） 霍尼韦尔贸易（上海）有限公司；磷酸二氢钾、甲醇（分析纯） 天津市福晨化学试剂厂；实验室用水均为高纯水（≥18 MΩ·cm）。

1.2 仪器与设备

1260型HPLC仪（配有可变波长紫外检测器、示差折光检测器和EZChrom Elite工作站） 美国安捷伦公司；Quattro Premier XE高压液相色谱-质谱仪（配有电喷雾离子源及MassLynx4.1软件操作系统） 美国Waters公司；DZG-303A“艾柯”实验室专用超纯水仪 成都唐氏康宁科技发展有限公司；Himac CR-20B2型高速冷冻离心机 日本日立公司；IKA A11基本型研磨机 广州仪科实验室技术有限公司；LGJ-10冷冻干燥机 北京松源华兴科技发展有限公司；电热恒温水槽 上海精宏仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

精确称取0.020 0 g cAMP标准品，用高纯水溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中，该储备液质量浓度200 mg/L，再依次配制成0.1、1、10、50、100 mg/L一系列不同质量浓度的标准工作溶液，过0.22 μm滤膜后进样。

1.3.2 水浴法提取cAMP

将籽瓜清洗、纵切、手动去籽、去表皮、分离瓜皮和瓜瓤、分别冷冻、粉碎、真空干燥、保存在-80 ℃冰箱。准确称取一定质量籽瓜冷冻样品，放入50 mL圆底烧瓶中；1）籽瓜冷冻鲜样以料液比为1∶12 （g/mL）加入高纯水摇匀后，在90 ℃条件下恒温水浴40 min；2）籽瓜干样以料液比1∶60 （g/mL）加入高纯水摇匀后，在90 ℃条件下恒温水浴40 min。分别提取2 次合并提取液10 000 r/min离心20 min，取上清液过0.22 μm滤膜后直接注入进样品以供分析。

1.3.3 高压液相色谱-质谱条件

色谱条件：Acuity C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：乙腈-0.1%甲酸（10∶90，V/V）溶液等度洗脱；流速0.3 mL/min；柱温40 ℃；进样量10 μL。

质谱条件：毛细管电压3.0 kV；脱溶剂温度350 ℃；锥孔气流50 L/h；干燥气为氮气，气流量为650 L/h；碰撞气体氩气；气体流量0.18 mL/min；电喷雾离子源；正离子模式扫描；多反应检测（multiple reaction monitoring，MRM）方式检测。其他参数见表1。

表1 检测cAMP的质谱条件Table 1 MS conditions for the detection of cAMP

1.3.4 高效液相色谱条件

色谱柱：Platisil ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢钾（15∶85，V/V）；流速1 mL/min；柱温30 ℃；检测波长259 nm；进样量20 μL。

1.3.5 提取条件优化

在提取温度90 ℃，提取时间30 min条件下，选取料液比（g/mL）：鲜样：1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12；干样：1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60。在料液比1∶6（鲜样）和1∶40（干样），提取时间30 min条件下，选取提取温度：60、70、80、90、95、100 ℃。在料液比1∶6（鲜样）和1∶40（干样），提取温度90 ℃条件下，选取提取时间：10、20、30、40、60 min。在料液比1∶6（鲜样）和1∶40（干样），提取温度90 ℃，提取时间30 min条件下，选取不同提取次数：鲜样： 1、2、3 次；干样：1、2、3、4 次。

2 结果与分析

2.1 籽瓜中cAMP的鉴定

对1 mg/L cAMP标准物质进行一级全扫描和子离子扫描，确定cAMP的前体离子和产物离子，选择2 个丰度较高、干扰较少的子离子作为定性离子和定量离子，其MRM色谱图如图1A所示。将籽瓜瓤样品按样品处理方法处理稀释后，进样10 μL，得到MRM色谱图如图1B所示。

图1 cAMP标准品和籽瓜样品MRM色谱图Fig.1 MRM chromatogram of cAMP standard solution and seeding watermelon sample

由图1可以看出，籽瓜样品中目标物质的峰与cAMP标准品的峰保留时间在误差范围内，选择的特征离子的保留时间及丰度之比与标准品的一致，确定目标物质为cAMP，该方法鉴定了籽瓜样品中含有cAMP。

2.2 cAMP提取条件优化

纯水作提取溶剂时cAMP的提取量较高[13]，故本实验用高纯水作提取剂。影响cAMP提取量的主要因素有料液比、提取温度、提取时间和提取次数。以cAMP的提取量为指标，采用单因素分析法对水浴提取参数进行优化。

图2 籽瓜鲜样提取条件优化图Fig.2 Optimization of extraction conditions for flesh seeding watermelon

图3 籽瓜干样提取条件优化图Fig.3 Optimization of extraction conditions for dry seeding watermelon

由图2、3可知，提取液使用量越大，提取量越高，但提取液使用量过高，cAMP的质量浓度越低，质量浓度太低会增加cAMP分离提取工作的负担[22]，料液比选择1∶12（鲜样）、1∶60（干样）。提取温度达到90 ℃时提取量较高，提取温度选择90 ℃。cAMP的含量随提取时间延长有较明显提高，当提取时间为40 min时，cAMP含量达到最大，随着提取时间的延长，提取量开始降低，可能由于提取时间过长，杂质溶出，影响了cAMP的提取[23]，故选择提取时间为40 min。不同提取次数对鲜样中cAMP含量影响较小，干样在提取3 次后提取量变化不明显，鲜样可提取2 次，干样提取3 次。

2.3 cAMP提取因素的正交优化

从以上单因素试验可以看出，提取量受料液比、提取温度、提取时间和提取次数4 个因素影响。为全面考察这4 个因素的作用大小和优化组合，设计了L9（34）正交试验。结果及数据处理见表2和表3。

由表2可知，影响籽瓜鲜样中cAMP提取率的主次因

素为A＞D＞C＞B，即料液比为最主要因素，提取温度、提取时间和提取次数均为次要因素。从各因素极差分析结果得出最佳提取条件为A3B2C2D3，由正交试验可知，最优组合为A3B2C1D3，通过验证实验确定提取工艺组合为A3B2C2D3，由于提取次数对鲜样中cAMP提取量影响较小，最终确定提取工艺为料液比1∶12、提取温度90 ℃、提取时间40 min、提取次数3 次。

由表3可知，影响籽瓜干样中cAMP提取率的主次因素为D＞A＞C＞B，即提取次数是最主要因素，料液比、提取温度和提取时间均为次要因素。从各因素极差分析结果得出最佳提取条件为A3B2C2D3，由正交试验可知，最优组合为A3B2C1D3，通过验证实验最终确定提取工艺组合为A3B2C2D3，即料液比1∶60、提取温度90 ℃、提取时间40 min、提取次数3 次。

表 2 L9（34）正交试验设计和结果（鲜样）Table 2 Results of L9 (34) orthogonal array design (flesh sample)

表 3 L9（34）正交试验设计和结果（干样）Table 3 Results of L9((334) orthogonal array design (dry sample)

2.4 标准品及籽瓜cAMP的色谱图

cAMP标准物质色谱图如图4所示。样品进行前处理后用HPLC进行分析，得籽瓜瓜瓤、瓜皮鲜样的色谱图如图5和图6所示，可见cAMP信号峰能与其他杂质峰分离且有较好峰形。

图4 标准品HPLC色谱图Fig.4 Chromatogram of cAMP standard

图5 籽瓜瓜瓤样品HPLC色谱图Fig.5 Chromatogram of cAMP from seeding watermelon flesh

图6 籽瓜瓜皮样品HPLC色谱图Fig.6 Chromatogram of seeding watermelon rind

2.5 方法学考察

2.5.1 标准曲线的绘制

选取不同质量浓度的cAMP标准工作溶液，每个质量浓度进样20 μL。以每个标准工作溶液对应的峰面积Y和其质量浓度X进行线性回归分析，得到回归方程Y=860 341.567 13X-91 953.292 8，R=0.999 9，cAMP标准曲线见图7。结果显示在0.1～100 mg/L范围内线性关系良好。

图7 cAMP标准曲线Fig.7 Standard curve of cAMP

2.5.2 精密度

取质量浓度10 mg/L的cAMP标准液自动进样20 μL，平行测定5 次，测定cAMP峰面积积分值，计算平均值和相对标准偏差（rel ative standard deviation，RSD），结果见表4。RSD为0.34%，说明精密度良好，满足实验要求。

表4 精密度实验结果（n=5）Table 4 Results of precise test (n =5)

2.5.3 重复性

精确称取相同质量的样品5 份，制备籽瓜提取液，分别进样20 μL，用HPLC仪测定峰面积，计算峰面积的RSD为2.28%，结果见表5。说明实验重复性良好。

表5 重复性实验结果（n=5）Table 5 Results of repeatability test (n=5)

2.5.4 回收率

精确称取相同质量的籽瓜瓜瓤样品5 份，分别加入一定量的cAMP标准物质，进行加标回收率实验，结果如表6所示。cAMP的回收率为92.93%～104.96%，RSD为3.22%，表明该方法能准确测定籽瓜中cAMP的含量。

表6 加标回收实验结果(n=5）Table 6 Results of recovery test (n =5)

2.6 籽瓜样品的测定

表7 籽瓜中cAMP的含量（n=3）Table 7 cAMP contents of the flesh and rind of seeding watermelon (n =3)

籽瓜瓜皮和瓜瓤中cAMP含量有较大区别，由表7可以看出，籽瓜瓜瓤中的cAMP含量高于瓜皮，大约是瓜皮的2～3 倍。

3 讨论与结论

本实验采用高压液相色谱-质谱法鉴定出籽瓜中含有cAMP，并建立HPLC法测定籽瓜中cAMP的含量，精密度和准确度均符合分析要求，方法回收率高、重复性好，cAMP的平均加标回收率为98.40%，重复测定的RSD为2.28%。通过单因素试验和正交试验对样品提取条件进行优化，最终选择提取条件：提取液为水、料液比1∶12（鲜样）和1∶60（干样）、提取温度90 ℃、提取时间40 min和提取次数3 次。该研究方法能够满足籽瓜中cAMP定性定量分析的要求。通过对新疆黑大片籽瓜样品中cAMP的检测，可知籽瓜瓜瓤中的cAMP含量较高，含量达到256.86 mg/kg（md）。下一步将研究新疆不同品种籽中cAMP含量的差异，为籽瓜资源的充分利用提供依据。

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Identification and Quantitation of Cyclic Adenosine 3’,5’-monophosphate in Seeding Watermelon by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry and High Performance Liquid Chromatography

XI Dong-hua1, GAO Jing2, PENG Xin-yuan1, WANG Qian3, LI Ling1, WU Bin3,*
(1. College of Chemistry and Chemical Engineering, Xinjiang University, Ürümqi 830046, China; 2. Center for Physics and Chemistry Analysis, Xinjiang University, Ürümqi 830046, China; 3. Institute of Agro-products Storage and Processing, Xinjiang Academy of Agricultural Sciences, Ürümqi 830091, China)

A method to identify cAMP using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MSMS) and to quantify the content of cAMP in seeding watermelon using high performance liquid chromatography (HPLC) was established. The quantitative method showed a good linear relationship in the cAMP concentration range from 0.1 to 100 mg/L with a correlation coefficient of 0.999 9. The average recovery for spiked samples was 98.40% with relative standard deviation (RSD) of 3.22% (n = 5). By using one-factor-at-a-time and orthogonal array designs, the optimum conditions for cAMP extraction were determined as follows: solid-to-water ratio; 1:12 (fresh sample) or 1:60 (dry sample); temperature, 90 ℃; extraction time, 40 min. This method is simple, accurate, reliable and reproducible, and can be used for the determination of cAMP in seeding watermelon.

seeding watermelon; cyclic adenosine 3’,5’-monophosphate (cAMP); liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS-MS); high performance liquid chromatography (HPLC)

O657.72

A

1002-6630（2014）18-0141-05

10.7506/spkx1002-6630-201418028

2013-11-27

新疆维吾尔自治区级公益性科研院所基本科研业务费专项（KY2013045；KY2014038）

席冬华（1990—），女，硕士研究生，研究方向为天然产物分析。E-mail：553764469@qq.com

*通信作者：吴斌（1973—），男，副研究员，博士，研究方向为农产品贮藏与加工。E-mail：xjuwubin0320@sina.com