三(2-氨基乙基)胺核聚酰胺胺树形分子的合成

吴江渝，黄维哲，周 婷，何紫莹

(武汉工程大学材料科学与工程学院，湖北 武汉 430074)

0 引 言

21世纪以来，世界癌症的发病率一直呈逐年上升之势，已经成为威胁人类健康的头号杀手.上世纪末出现基因治疗技术，将很有可能成为人类21世纪攻克癌症的有力工具[1].在基因治疗中，安全而有效的基因载体系统是保障外源基因在目的细胞中高效、稳定的表达以及成功开展基因治疗的重要基础.树形分子作为一种非病毒基因及药物载体，具有良好的水溶性、生物相容性和低免疫原性，因而广泛用于基因转染和药物输送研究.由于与传统大分子的聚合反应不同，树形分子一般通过逐步合成得到，因此其分子大小、形状和表面官能团数目可以得到精确控制[2-6].

聚酰胺胺(polyamidoamine，PAMAM)树形分子是研究最早，应用最广泛的树形分子类别，传统的聚酰胺胺树形分子以乙二胺或氨为核，通过反复的迈克尔加成反应和酰胺化反应得到[7-9].研究表明，树形分子的柔顺性及表面官能团密度会影响其在生物医药领域如基因转染和药物传递方面的生物活性及细胞毒性[10].通过选择不同的核单元结构，可以有效控制聚酰胺胺树形分子的核单元大小，从而调节分子的结构柔顺性及其表面官能团密度.

本文以三(2-氨基乙基)胺(tri(2-aminoethyl)amine，TAEA)为核，通过发散法利用交替的迈克尔加成和酰胺化反应合成第一代到第四代的酯基末端及氨基末端聚酰胺胺树形分子，并通过红外光谱和核磁波谱氢谱对所合成的树形分子化合物进行了结构表征.与传统的氨核树形分子以及本实验室前期工作合成的树形分子化合物相比[11-12]，三(2-氨基乙基)胺结构的引入使得所合成的聚酰胺胺树形分子核单元更小，分子结构更为紧密.因此，在相同代数情况下，该系列树形分子具有较高的表面官能团密度，以及较低的分子柔顺性.

1 实验部分

1.1 试剂和仪器

试剂：三(2-氨基乙基)胺，乙二胺(国药集团生产，化学纯，使用前重蒸)，丙烯酸甲酯(国药集团生产，化学纯，使用前重蒸)，甲醇(国药集团生产，化学纯，使用前重蒸)，二氯甲烷(国药集团生产，化学纯)，乙酸乙酯(国药集团生产，化学纯)，石油醚(国药集团生产，化学纯)，无水乙醚(国药集团生产，化学纯)，薄层层析硅胶板(青岛海洋化工厂，试剂级)，石英砂(天津市南开化工厂，分析纯)，柱层层析硅胶(青岛海洋化工厂，试剂级).

仪器：85-2型恒温磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限公司)，RE-52型旋转蒸发器(上海市嘉鹏科技有限公司)，JA3003N电子天平(上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂)，循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)，2XZ-4型旋片式真空泵(临海市谭氏真空设备有限公司)，Nicolet6700型傅里叶红外光谱仪(美国Thermo Electron公司)，Agilent 400MR型核磁共振波谱仪(美国Agilent公司).

1.2 合成方法

以三(2-氨基乙基)胺为出发点，通过与过量的丙烯酸甲酯反应得到末端为酯基的0.5代聚酰胺胺树形分子G0.5-PAMAM.G0.5-PAMAM树形分子再与过量的乙二胺反应，得到末端为氨基的1代树形分子G1.0-PAMAM.重复以上步骤，可分别得到酯基末端的G1.5-PAMAM、G2.5-PAMAM、G3.5-PAMAM以及氨基末端的G2.0-PAMAM、G3.0-PAMAM、G4.0-PAMAM树形分子.由于丙烯酸甲酯和乙二胺化学性质活泼，本实验可在常温下进行，无需升温处理.合成路线如图1所示.

图1 三(2-氨基乙基)胺核聚酰胺胺树形分子的合成Fig.1 Synthesis of PAMAM dendrimers with TEAE core

具体合成步骤如下：

a.G0.5-PAMAM树形分子的合成：

将过量的新蒸丙烯酸甲酯溶于10 mL甲醇中，搅拌状态下向其中滴加适量的三(2-氨基乙基)胺，在氮气保护的状态下避光反应36 h.采用甲醇作展开剂，经薄层层析色谱(TLC)检验证明三(2-氨基乙基)胺已反应完全.停止反应，旋蒸除去溶剂甲醇及过量的丙烯酸甲酯，得到淡黄色黏稠状粗产物.采用甲醇∶二氯甲烷=1∶20(体积比)作淋洗剂，通过柱层析分离提纯得到淡黄色黏稠状液体G0.5-PAMAM，产率为75%.

b.G1.0-PAMAM树形分子的合成：

将过量的新蒸乙二胺溶于12 mL甲醇中，搅拌状态下向其中滴加适量的G0.5-PAMAM，在氮气保护的状态下反应24 h.采用甲醇∶二氯甲烷=1∶20(体积比)作展开剂，经TLC检验和红外光谱分析证明G0.5-PAMAM已反应完全.停止反应，旋蒸除去溶剂甲醇及大部分过量的乙二胺，得到淡黄色黏稠状粗产物.将粗产物溶于少量甲醇，250 mL乙醚反复沉降3次，油泵减压抽除残余的乙二胺，直至TLC检验无乙二胺为止，得到淡黄色黏稠状液体G1.0-PAMAM，产率为92%.

c.G1.5-PAMAM树形分子的合成：

将过量的新蒸丙烯酸甲酯溶于15 mL甲醇中，搅拌状态下向其中滴加适量的G1.0-PAMAM，在氮气保护的状态下避光反应36 h.采用甲醇作展开剂，经TLC检验证明G1.0-PAMAM已反应完全.停止反应，旋蒸除去溶剂甲醇及过量的丙烯酸甲酯，得到淡黄色黏稠状粗产物.采用甲醇∶二氯甲烷=10∶1(体积比)作淋洗剂，通过柱层析分离提纯得到淡黄色黏稠状液体G1.5-PAMAM，产率为76%.

d.G2.0-PAMAM树形分子的合成：

将过量的新蒸乙二胺溶于15 mL甲醇中，搅拌状态下向其中滴加适量的G1.5-PAMAM，在氮气保护的状态下反应24 h.采用甲醇作展开剂，经TLC检验和红外光谱分析证明G1.5-PAMAM已反应完全.停止反应，旋蒸除去溶剂甲醇及大部分过量的乙二胺，得到淡黄色黏稠状粗产物.将粗产物溶于少量甲醇，250 mL乙醚反复沉降3次，油泵减压抽除残余的乙二胺，直至TLC检验无乙二胺为止，得到淡黄色黏稠状液体G2.0-PAMAM，产率为95%.

重复以上步骤，即得到G2.5-PAMAM至G4.0-PAMAM各代树形分子.

2 结果与讨论

2.1 红外表征(IR)

本实验所用的产品均为液态，红外光谱的测定采用涂膜法.图2为酯基末端树形分子的红外光谱图，图3为氨基末端树形分子的红外光谱图.

图2 酯基末端树形分子的红外光谱图Fig.2 IR spectra of ester-terminating PAMAM dendrimers

图3 氨基末端树形分子的红外光谱图Fig.3 IR spectra of amino-terminating PAMAM dendrimers

由图可知，在3 300～3 500 cm-1处出现的峰为N-H的伸缩振动吸收峰，在2 943 cm-1附近出现的为亚甲基的C-H伸缩吸收峰，1 440 cm-1附近的峰为亚甲基的C-H的弯曲振动吸收峰.1 560 cm-1附近为酰胺羰基的N-H和C-N的弯曲振动吸收峰，1 650 cm-1附近为酰胺羰基中-CO-的伸缩振动吸收峰，两个连续的吸收峰能证明分子中含有-CONH-结构.酯基末端树形分子和氨基末端树形分子最明显的区别在于1 730 cm-1附近的酯羰基伸缩振动的特征吸收峰.对于G0.5-PAMAM，G1.5-PAMAM，G2.5-PAMAM，G3.5-PAMAM，由于其末端基团为酯基，因此其在1 730 cm-1附近的酯羰基伸缩振动吸收峰能明显观察到(见图2).对于G1.0-PAMAM，G2.0-PAMAM，G3.0-PAMAM，G4.0-PAMAM，由于其末端基团为氨基，结构中不存在酯基，因此其在1 730 cm-1附近不存在吸收峰(见图3).通过观察酯羰基伸缩振动吸收峰的出现和消失，可验证酯基是否与胺基完全反应.这些特征峰的存在能定性地表征化合物中特征集团的存在，同时能进一步反映反应的进程和产物的结构.

2.2 核磁表征(1H-NMR)

为进一步证实目标产物的分子结构，我们对所合成的各代树形分子化合物进行了核磁共振氢谱表征.对于酯基末端的树形分子，所用核磁溶剂为CDCl3；对于氨基末端的树形分子，所用核磁溶剂为D2O.由于分子中不同化学环境的氢原子能在核磁共振氢谱中表现出不同的化学位移，因此通过观察核磁谱图中氢原子共振吸收峰的化学位移及吸收峰面积，可以推断所合成化合物的分子结构.

对于G0.5-PAMAM(图4)，测试数据如下，1H-NMR(CDCl3)δ∶3.67 (18H, OCH3)，2.75(12H, NCH2CH2COO)，2.51(12H, NCH2CH2N)，2.46(12H, NCH2CH2COO).根据化学位移将其氢原子划分为3类(化学位移分别在3.6～3.8，2.7～2.9，2.4～2.6之间的吸收峰对应不同种类的氢原子)，3种氢原子的个数比为3∶2∶4，其对应的吸收峰的积分面积之比约为24.5∶16.7∶32.4，这与氢原子的个数比吻合，故证明所得产物为纯净的G0.5-PAMAM.

图4 G0.5-PAMAM树形分子核磁共振氢谱Fig.4 1H-NMR spectrum of G0.5-PAMAM dendrimer

对于G1.0-PAMAM(图5)，测试数据如下，1H-NMR(D2O)δ∶3.12 (12H, CONHCH2CH2CH3),2.70(12H, CONHCH2CH2CH3),2.64(12H, NCH2CH2CO),2.46(12H, NCH2CH2N)，2.27(12H, NCH2CH2CO).根据化学位移将其氢原子划分为4类(化学位移分别在在3.0～3.25，2.55～2.8，2.4～2.55，2.2～2.35的吸收峰对应的不同种类的氢原子)，4种氢原子的个数比为1∶2∶1∶1，其对应的吸收峰的积分面积之比约为1.09∶1.98∶0.98∶1.00，这与氢原子的个数比基本吻合，故证明所得产物为纯净的G1.0-PAMAM.

对于G1.5-PAMAM(图6)，与G0.5-PAMAM类似，根据化学位移将其氢原子划分为3类(化学位移分别在在3.50～4.00，3.50～3.00，3.00～2.40的吸收峰对应的不同种类的氢原子)，3种氢原子的个数比为3∶1∶8，其对应的吸收峰的积分面积之比约为5.88∶2.34∶17.04，这与氢原子的个数比基本吻合，故证明所得产物为纯净的G1.5-PAMAM.

图5 G1.0-PAMAM树形分子核磁共振氢谱Fig.5 1H-NMR spectrum of G1.0-PAMAM dendrimer

图6 G1.0-PAMAM和G1.5-PAMAM树形分子核磁共振氢谱Fig.6 1H-NMR spectra of G1.5-PAMAM and G2.0-PAMAM dendrimers

对于G2.0-PAMAM(图6)，与G1.0-PAMAM类似，根据化学位移将其氢原子划分为3类(化学位移分别在在3.30～3.46，2.4～3，2.20的吸收峰对应的不同种类的氢原子)，3种氢原子的个数比为3∶7∶3，其对应的吸收峰的积分面积之比约为11.3∶27.5∶11，这与氢原子的个数比基本吻合，故证明所得产物为纯净的G2-PAMAM.

所合成的其它代数化合物，即G2.5-PAMAM，G3.0-PAMAM，G3.5-PAMAM，G4.0-PAMAM树形分子的核磁共振氢谱如图7所示，与前文讨论类似，通过吸收峰的化学位移和积分面积分析，均能证明所得产物即为目标树形分子.

图7 G2.5-PAMAM、G3.0-PAMAM、G3.5-PAMAM、G4.0-PAMAM的核磁共振氢谱Fig.7 1H-NMR spectra of G2.5-PAMAM,G3.0-PAMAM,G3.5-PAMAM and G4.0-PAMAM dendrimers

3 结 语

聚酰胺胺树形分子作为一种潜在的基因及药物载体材料而广泛用于基因治疗研究，其生物活性和细胞毒性与其分子的结构柔顺性和表面官能团密度密切相关.本文以三(2-氨基乙基)胺为核出发，采用交替的迈克尔加成反应和酰胺化反应合成得到从0.5代到4代酯基末端和氨基末端的树形分子，并通过红外光谱和核磁共振氢谱分析证实了目标化合物的结构.与传统的氨核以及本实验室合成的其他聚酰胺胺树形分子相比，该系列聚酰胺胺树形分子的核单元更紧凑，从而使分子的柔顺性降低，表面官能团密度增大.其结构上的改变能影响树形分子在基因转染和药物传递中的生物活性，对安全高效的树形分子载体试剂开发具有重要意义.

致 谢

本研究得到国家自然科学基金委员会提供的资金资助，特表感谢！

[1] MILLER A D.Human gene therapy comes of age[J].Nature,1992,357(6378):455-460.

[2] MAJOROS I J,THOMAS T P,MEHTA C B,et al.Poly(ami-doamine) dendrimer-based multifunctional engineered nanodevice for cancer therapy[J].Journal of Medicinal Chemistry,2005,48(19):5892-5899.

[3] MAJOROS I J,MYC A,THOMAS T,et al.PAMAM dendrimer-based multifunctional conjugate for cancer therapy:synthesis,characterization,and functionality[J].Biomacromolecules,2006,7(2):572-579.

[4] ZHU S,HONG M,ZHANG L,et al.PEGylated PAMAM dendrimer-doxorubicin conjugates:in vitro evaluation and in vivo tumor accumulation[J].Pharmaceutical Research,2010,27(1):161-174.

[5] SHI X,WANG S H,SHEN M,et al.Multifunctional dendrimer-modified multiwalled carbon nanotubes:synthesis,characterization,and in vitro cancer cell targeting and imaging[J].Biomacromolecules,2009,10(7):1744-1750.

[6] ZHANG Y,SUN Y,XU X,et al.Synthesis,biodistribution,and microsingle photon emission computed tomography (SPECT) imaging study of technetium-99m labeled PEG ylated dendrimer poly (amidoamine)(PAMAM)- folic acid conjugates[J].Journal of Medicinal Chemistry,2010,53(8):3262-3272.

[8] DYKES G M.Dendrimers:a review of their appeal and applications[J].Journal of Chemical Technology and Biotechnology,2001,76(9):903-918.

[9] IYYAMPERUMAL R,ZHANG L,HENKELMAN G,et al.Efficient electrocatalytic oxidation of formic acid using Au@ Pt dendrimer-encapsulated nanoparticles[J].Journal of the American Chemical Society,2013,135(15):5521-5524.

[10] LIU X X,WU J Y,YAMMINE M,et al.Structurally flexible triethanolamine core PAMAM dendrimers are effective nanovectors for DNA transfection in vitro and in vivo to the mouse thymus[J].Bioconjugate Chemistry,2011,22(12):2461-2473.

[11] WU J Y,ZHOU J H,QU F,et al.Polycationic dendrimers interact with RNA molecules:polyamine dendrimers inhibit the catalytic activity of Candida ribozymes[J].Chemical Communications,2005 (3):313-315.

[12] 吴江渝,徐美英,黄维哲,等.新型聚酰胺胺树形分子的合成及表征[J].武汉工程大学学报,2013,35(5):47-51.

WU Jiang-yu,XU Mei-ying,HUANG Wei-zhe,et al.Synthesis and characterization of new type of polyamidoamine dendrimer[J].Journal of Wuhan Institute of Technology,2013,35(5):47-51.(in Chinese)