人乳脂替代品的酶法合成及其评价的研究进展

钟金锋，覃小丽，*，王永华

（1.西南大学食品科学学院，重庆400715；2.华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640）

人乳脂替代品的酶法合成及其评价的研究进展

钟金锋1，覃小丽1，*，王永华2，*

（1.西南大学食品科学学院，重庆400715；2.华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640）

由于经济、社会和个人因素方面，我国及其他一些发展中国家的婴儿纯母乳喂养率普遍偏低。与植物油和反刍动物乳脂相比，人乳脂中棕榈酸分布在甘油骨架的sn-2位更有利于婴儿对脂肪酸和钙的吸收，减少婴儿便秘、上火等。合成与人乳脂相似的人乳脂替代品，将其作为婴儿配方奶粉的脂肪来源具有着重要的市场潜力。酶法催化具有反应条件温和、高度位置专一性和脂肪酸专一性，因此，可以通过sn-1，3位专一性脂肪酶催化合成人乳脂替代品。本文介绍了人乳脂替代品的定义及发展，并就近年来的酶法合成人乳脂替代品的底物选择、脂肪酶筛选、合成方法与技术、检测分析方法、相似度评价以及氧化稳定性等方面的研究状况进行系统阐述，并对今后人乳脂替代品研究做了展望。

人乳脂替代品，脂肪酶，相似度，酯交换，评价

人乳是婴儿最佳的天然营养食品。大量研究[1-3]证明，纯母乳喂养可以满足婴儿对各种营养素的需要，大大减少婴儿患腹泻几率，预防各种传染病和营养不良的发生，降低新生儿死亡率。而我国近年来母乳喂养的现状更是不容乐观，日前卫生部公布的6个月内婴儿的纯母乳喂养率仅为27.6%，远低于世界卫生组织制定的《婴幼儿喂养全球战略》中提出的6个月内100%纯母乳喂养率。近几十年以来，随着社会的发展，生活节奏的加快，妇女就业机会的增多，婴儿奶粉的强势销售等经济、社会和个人因素方面，我国及其他一些发展中国家的纯母乳喂养率普遍偏低是不争的事实。因此，在提倡纯母乳喂养的前提下，当母乳不足或缺乏母乳喂养条件等情况下，婴儿配方奶粉成为供给婴儿健康成长和发育的理想辅助食品。传统婴幼儿配方奶粉的脂肪主要由牛乳脂和多种植物油脂组成，通过添加多种植物油脂虽然可使其脂肪酸含量与人乳脂肪的相接近，但是大多数婴

儿配方奶粉的脂肪结构往往与人乳脂的差异较大。人乳脂是人乳中主要营养物质之一，其不仅提供给婴儿所需的45%左右的能量，而且提供给婴儿生长发育所必需的脂肪酸。大量研究[4-5]表明，人乳脂是一种在甘油骨架sn-2位上富含棕榈酸的结构酯，能够帮助婴儿最大限度地吸收钙质，显著地降低婴儿便秘、腹痛和肠阻的可能性；而天然存在的普通植物油和反刍动物乳脂的脂肪结构与人乳脂的恰好相反，即棕榈酸则主要分布在sn-1，3位，难以被婴儿吸收利用，并容易在体内与钙质形成不溶性钙皂后随粪便排出，从而导致能量和钙质的双重流失，容易使婴儿便秘、上火，甚至抵抗力降低（图1）[1，4]。可见，开发一种脂肪酸组成和脂肪结构都接近人乳脂的人乳脂替代品尤为重要。韩露露等[6]和张超越等[7]对人乳脂中甘油三酯的结构及组成的特殊性，人乳脂消化吸收的特点以及人乳脂替代品的酶法合成技术进行了总结。然而，关于人乳脂替代品的检测技术及其产品质量评价等方面的研究进展未见报道。因此，本文对人乳脂替代品的合成技术、检测方法，人乳脂替代品与人乳脂相似度评价以及人乳脂替代品的氧化稳定性评价的最新研究进展做系统的阐述，为今后研究提供一些借鉴与启示。

图1 甘油三酯（人乳脂和普通植物油）在体内代谢过程Fig.1 Metabolic processes of humanmilk fatand vegetable oils

1 人乳脂替代品的定义及发展

人乳脂替代品（HMFS）是一种模拟人乳脂的脂肪酸组成及其位置分布的甘油三酯混合物，可作为重要油脂基料并添加于婴儿配方奶粉中。人乳脂替代品是利用现代酶技术对植物油或动物脂肪进行改性并结合新型分离技术进行分离精制所得的产品，使其中的脂肪酸组成及其位置分布均接近人乳脂。婴儿配方奶粉的营养学和临床医学研究至今已有一百多年的历史。油脂作为婴儿配方奶粉的重要配料，其应用于配方奶粉中的进程也逐步由宏观走向了微观。宏观上，配方奶粉脂肪的脂肪酸含量要接近人乳脂，故通常选用牛乳为配方奶粉的主要脂肪成分，通过添加多种植物油以提高乳脂中不饱和脂肪酸的比例，使各个脂肪酸含量在一定范围内。然而，微观上脂肪结构却存在很大差别，即无论是牛乳脂肪还是普通植物油的甘油三酯结构都与人乳脂的存在明显差别。因此，开发一种与人乳脂脂肪酸组成及其位置分布均相似的人乳脂替代品的研究就应运而生了。近二十年来，一些营养学及临床医学研究者不同脂肪酸结构的油脂对婴儿营养吸收的影响开展了研究，结果表明棕榈酸位于sn-2位的油脂优于其位于sn-1，3位的棕榈油等植物油。随着酶工程技术和脂肪酶技术的发展，以sn-1，3位专一性脂肪酶为催化剂通过酯交换反应获得与人乳脂相似的人乳脂替代品成为可能。国外Loders Crok laan（Univer）公司取得生产人乳脂替代品的专利，产品为BetapolTM，是通过Lipozyme RM IM催化三棕榈酸甘油酯（PPP）和油酸（O）合成1，3-二油酸-2棕榈酸甘油酯（OPO）型人乳脂替代品，目前正进行商业化生产。值得重视的是，在2008年中华人民共和国卫生部第13号公告批准了OPO作为营养强化剂可添加到婴儿配方奶粉中。然而到目前为止，国内还没有OPO型人乳脂替代品的生产厂家。国内一些研究者对酶法催化合成人乳脂替代品的研究正处于起步阶段。

2 人乳脂替代品的酶法合成

2.1 底物的选择

人乳脂具有独特的脂肪结构，即棕榈酸主要分布在甘油骨架的sn-2位上，不饱和脂肪酸（油酸和亚油酸）则主要在sn-1，3位。以人乳脂的脂肪酸组成及其分布为“黄金标准”，按照一定比例组成的sn-2富含棕榈酸的油脂与酰基供体混合物在sn-1，3位专一性脂肪酶的催化作用下进行反应，以期得到一种与人乳脂的脂肪酸组成及其分布相似的人乳脂替代品。理论上，天然存在的普通植物油和动物脂肪都可以作为合成人乳脂替代品的原料，但绝大部分油脂的脂肪酸组成及其分布与人乳脂存在一定差别（表1）。为了有效合成sn-2位棕榈酸和sn-1，3位不饱和脂肪酸（OPO）为主的人乳脂替代品，通常选择富含中链脂肪酸（C12∶0、C14∶0）的椰子油和富含不饱和脂肪酸的茶油和大豆油等为酰基供体以及sn-2位富含棕榈酸的棕榈硬脂、猪油和牛乳脂等为反应底物。此外，还可以通过非专一性脂肪酶（如Novozym 435，Lipase QLM和QLC from A lcaligenes sp.）催化棕榈硬脂与棕榈酸的酸解反应获得sn-2位富含棕榈酸的甘油三酯作为反应底物[8]。人乳脂中含有少量的DHA（0.5w t%）和AA（0.5w t%），因此，金枪鱼油和海藻油等也作为多不饱和脂肪酸酰基供体来源，但由于多不饱和脂肪酸极易与氧发生氧化反应使油脂变质。一般情况下，富含DAH和AA等油脂不经酶法改性而直接添加到婴儿配方奶粉生产过程中。

2.2 脂肪酶的选择

与传统的化学催化相比，酶法催化因其反应条件温和、特异性（位置专一性和脂肪酸专一性）强、催化效率高、易于控制等优点，酶法催化合成与人乳脂结构相似的人乳脂替代品成为可能。可用于催化合成人乳脂替代品的脂肪酶主要是sn-1，3位特异性脂肪酶，目前，应用较为广泛的商业化脂肪酶是丹麦Novozymes公司生产的Lipozyme RM IM和Lipozyme

TL IM。由于基因工程技术的出现，许多新的、具有特定功能的脂肪酶在原有微生物脂肪酶基因的基础上通过基因重组技术先后开发并成功应用于油脂的改性制备结构脂[18-19]。除了微生物来源的脂肪酶，从植物中提取的脂肪酶也是潜在催化剂而应用于油脂改性。Tecelāo等[20]考察了大量存在于木瓜乳的番木瓜脂肪酶作为一种廉价的生物催化剂可催化PPP和油酸合成人乳脂替代品。

表1 常见油脂与乳脂的主要脂肪酸组成及其分布（%）Table 1 Fatty acid composition and distribution of common oils and milk fats（%）

在酶法催化合成人乳脂替代品中，影响脂肪酶的催化活性及其稳定性的因素主要有：pH、水分含量、反应温度、脂肪酶固定化载体。一般地，来源于细菌的脂肪酶最适pH在中性或微碱性范围内[21]，而由真菌产生的脂肪酶的最适pH在中性或微酸性范围内[22]。体系pH对脂肪酶活性的影响主要发生在油脂的水解反应中，主要是由于油脂与水发生反应不断生成的游离脂肪酸呈弱酸性，因此，在脂肪酶催化油脂水解反应，缓冲溶液的不同pH对油脂水解率的影响是重点考察因素之一。反应体系中的水分含量主要由酶本身、底物及额外添加的水分组成，水分含量是影响微水相或非水相催化反应速度和产物得率及组成的重要因素之一。一般来说，脂肪酶催化酯交换反应中，其水分含量占酶质量的3%～15%。在合适的水分含量范围内，反应速度和产物得率随着水分含量的增大而提高。然而，在较低水分含量时，脂肪酶周围的必需水含量不足，不能维持酶的活性构像，从而不利于脂肪酶催化活性的发挥；较高的水分含量虽然对反应速率及得率影响不大，但增加副产物生成和影响目标产物的纯度。Xu等[23]研究表明，Lipozyme IM在无溶剂体系中催化菜籽油和辛酸合成MLM型结构脂中，水分含量对酰基转移（辛酸从sn-1，3位转移到sn-2位）有显著影响；当水分含量从3.25%增加到10.25%时，辛酸转移水平呈线性提高（从4%到12.2%），从而导致LMM等副产物生成。此外，其他研究表明水分含量对不同反应底物[24]，以及不同脂肪酶[25]有不同影响。因此，在不同的反应体系中，对体系中水含量应有不同的调整以达到可接受的反应速率和产物产率。

反应温度是影响脂肪酶催化活性又一重要因素。一般地，酶促反应温度控制在40～60℃。较低的反应温度影响反应速度，且反应时间较长；而过高的反应温度容易使酶失活，影响酶的热稳定性。热稳定性是脂肪酶是否能实现工业化应用的关键因素之一，因此，在考察温度对其酶活发挥的同时，对酶的热稳定性的评价是不可忽略的环节。Zou等[26]考察了Lipozyme RM IM在催化合成人乳脂替代品反应后回收连续重复使用17次，结果表明了Lipozyme RM IM的酶活力降低不明显，具有良好的稳定性。

2.3 酶法合成人乳脂替代品的方法

人乳脂替代品的合成可在不同反应条件下采用不同脂肪酶催化不同底物和酰基供体，通过一步或多步酶法（酯化反应、酸解反应和酯-酯交换反应相结合）完成。图2[27]为常见的脂肪酶催化合成人乳脂替代品的反应类型和反应机理。

2.3.1 一步酶法合成人乳脂替代品 一步酶法合成

人乳脂替代品主要有酯-酯交换法和酸解法，其中酸解法是研究应用最多的方法。酸解法制备人乳脂替代品通常以sn-2位富含棕榈酸的甘油酯为底物及游离不饱和脂肪酸为酰基供体，在sn-1，3位专一性脂肪酶的作用下发生酰基交换反应，将不饱和脂肪酸结合到甘油酯的sn-1，3位上，考察人乳脂替代品的肪酸酸组成及其分布、物理特性以及确定最佳反应条件。由Loders Croklaan（Unilever）公司[28]生产的BetapolTM和Advanced Lipids（AAK和Enzymotec）合资公司[29]生产的InfatTM正是采用sn-1，3位专一性脂肪酶催化酸解sn-2位富含棕榈酸的植物油为底物和游离脂肪酸为酰基供体一步酶法合成富含OPO的甘油酯；该商品化产品作为婴儿配方奶粉的油脂主要基料，利于婴儿对脂肪和钙质吸收，减少便秘。从图2可看出，富含油酸的游离脂肪酸结合到甘油三酯的理论插入率为66.67%，而在大量的研究[30-32]中，油酸插入率一般为30%～50%。特别是以PPP作为底物，因PPP的sn-1，3位棕榈酸未完全被油酸替代，实际上棕榈酸分布在sn-2位的相对含量较低（55%）[30]，这一数据与人乳脂中棕榈酸分布在sn-2位的相对含量（＞70%）还存在很大差距。在动物脂肪中，猪油的结构与人乳脂极其相似，其棕榈酸分布在sn-2位的相对含量高达85%（表1）。Qin等[32]和Yang等[33]采用Lipozyme RM IM为催化剂分别催化酸解分提后猪油（34L-猪油）和猪油，产物中棕榈酸分布在sn-2位的相对含量仍保持较高水平（～80%），得到与人乳脂的结构非常相似的OPO型人乳脂替代品。在酶促酸解合成人乳脂替代品过程中，各种反应条件不仅影响酸解程度，而且还影响目标产物得率或纯度。酶促酸解反应过程包括两个连续的反应步骤（水解反应和酯化反应），其中水解步骤生成中间产物2，3-甘油二酯或1，2-甘油二酯。这两种甘油二酯存在非热力学稳定性，容易转化为1，3-甘油二酯，而这三种甘油二酯处于一定的动态平衡。在酸解的第二个步骤中，脂肪酶将酰基供体（游离脂肪酸酰基）转移到甘油二酯异构体中，形成目标产物的同时生成了一种新的甘油三酯副产物。酰基转移是指甘油酯中sn-2位脂肪酸迁移到sn-1，3位或从sn-1，3位迁移到sn-2位；其作为一种副反应是不可避免的，从而导致产物中目标甘油三酯的纯度降低，影响了产物的质量。酰基转移水平受体系水分含量、反应温度、酶添加量的增加而显著地提高[23]。Yang等[34]在Lipozyme RM IM催化酸解PPP和共轭亚油酸或辛酸过程中通过程序式控制反应温度可以有效地降低酰基转移水平。因此，合成人乳脂替代品过程中，考察反应条件对酸解程度（插入率）的影响的同时，如何控制由酰基转移引起的副产物的生成量也值得探讨。

图2 Sn-1，3位专一性脂肪酶催化合成人乳脂替代品的反应类型及反应机理Fig.2 Reaction types andmechanisms for enzymatic synthesis of humanmilk fat substitutes

酶促酯-酯交换法合成人乳脂替代品通常是以多种植物油混合物、植物油与动物油脂混合物、植物油或动物油脂与简单酰基酯混合物为反应底物，在脂肪酶催化下进行酶促转酯反应而得到（图2）。与酶促酸解法相比，酶促酯-酯交换法合成人乳脂替代品的相关研究较少。这主要由于当两种或多种油脂进行酶促酯-酯交换反应时，所得的目标产物难以与未反应的底物分离，虽然产物的脂肪酸组成与人乳脂的接近，但其脂肪结构不能很好的符合人乳脂结构[35]。一般情况下，油酸甲酯作为酰基供体（酯-酯交换）的酸解程度（油酸插入率）高于以油酸作为酰基供体（酸解反应）[36]，但后续的分离纯化中脂肪酸甲（乙）酯要比脂肪酸的分离难度大。Lee等[37]以PPP和油酸乙酯为底物，通过sn-1，3位专一性脂肪酶Lipozyme TL IM催化进行酯-酯交换反应，通过响应面优化底物摩尔比、反应温度和反应时间得到富含OPO型人乳脂替代品，其中油酸插入率为44.8%，棕榈酸分布在sn-2位的相对含量为58.5%。

除了合成以OPO为主的人乳脂替代品之外，一些研究者以酶法酸解或酯-酯交换法合成人乳脂替代品营养补充剂——sn-1，3位多不饱和脂肪酸和sn-2位饱和脂肪酸的甘油酯[38-40]。多不饱和脂肪酸（如：亚麻酸、DHA、EPA、AA）在人乳脂中的含量虽然低，但对婴儿的神经系统、大脑及视觉发育等密切相关。Teichert和Akoh[41]以Lipozyme TL IM催化PPP和富含十八碳四烯酸（C18∶4n-3）的大豆油酯交换反应，利用响应面优化反应条件为反应温度50℃，大豆油与PPP摩尔比为1∶2，反应时间18h及酶添加量10%，合成的结构脂中C18∶4n-3含量为5.4%，棕榈酸分布在sn-2位的相对含量仅为32.6%，该结构脂作为ω-3脂肪酸的来源，将来可添加到婴儿配方奶粉中。

2.3.2 多步酶法合成人乳脂替代品 虽然一步酶法催化酸解或酯-酯交换反应合成OPO型人乳脂替代品工艺简单及容易控制，但是油酸插入率（～50%）或OPO纯度（～43%）较低。因此，一些研究者通过两步或三步酶法催化合成工艺以期获得高纯度的OPO。2.3.2.1 两步酶法合成人乳脂替代品 以PPP为初始原料，人乳脂替代品的两步酶法合成工艺包括：a.通过sn-1，3位专一性脂肪酶醇解sn-2位富含棕榈酸的

甘油三酯，得到2-棕榈酸甘油一酯；b.采用脂肪酶催化2-棕榈酸甘油一酯与油酸的酯化反应合成OPO（图2）。Schm id等[42]成功地建立了两步酶法合成OPO型人乳脂替代品：首先考察了3种脂肪酶（Lipozyme RM from Rhizomucorm iehei、RDL from Rhizopus delemar、RJL from Rhizopus javanicus）在甲基-t-丁基醚有机溶剂中分别催化乙醇解PPP制备2-棕榈酸甘油一酯，然后经溶剂结晶获得纯度为95%的2-棕榈酸甘油一酯；第二步OPO的合成是在正己烷中以脂肪酶Lipozyme RM或RDL催化2-棕榈酸甘油一酯与油酸的酯化反应，获得甘油三酯产物中OPO纯度分别为70%和72%。在此研究的基础上，Schmid等[43]进一步研究了不同水分活度及RDL酶的不同固定化载体对这3种脂肪酶在不同有机溶剂中催化乙醇解反应中2-棕榈酸甘油一酯生成量的影响；同时进一步详细探讨了水分活度对Lipozyme RM和RDL脂肪酶在无溶剂或有机溶剂中合成OPO的影响，最终获到OPO纯度为78%。为了验证两步酶法合成OPO的可行性，Pfeffer等[44]采用同一种脂肪酶（Novozym 435）先后在丙酮中催化乙醇解PPP制备2-棕榈酸甘油一酯和在正己烷中催化2-棕榈酸甘油一酯与油酸的酯化反应制备OPO型人乳脂替代品；并通过放大反应得到了198g OPO型人乳脂替代品（纯度95%），为将来大批量生产OPO型人乳脂替代品提供基础数据和实践指导；该研究仅采用同一种脂肪酶就能实现两步酶法合成，以及使用的溶剂（丙酮和正己烷）属于食品级，最低限度减少人乳脂替代品中有毒残留物。

2.3.2.2 三步酶法合成人乳脂替代品 三步酶法合成工艺是以棕榈油为起始原料，包括酯化、甘油解和酸解。Chen等[45]建立了三步酶法合成OPO型人乳脂替代品：a.对棕榈油进行皂化、分离纯化后分别得到棕榈酸和油酸；采用脂肪酶PS 30催化棕榈酸与乙醇的酯化反应合成棕榈酸乙酯；b.比较Novozym 435和Lipozyme IM 60催化棕榈酸乙酯甘油解合成PPP的效果；c.考察了底物摩尔比、酶添加量、反应温度和水分含量对Lipozyme IM 60催化PPP和油酸的酸解反应中油酸插入随时间变化的影响，在优化反应条件下OPO型人乳脂替代品中油酸插入率为66%及OPO纯度为74%。该工艺合成得到的人乳脂替代品中OPO纯度与两步酶法的相当，但工艺复杂，涉及3种脂肪酶，使产品成本较高，也不利于大规模生产的管理。

2.4 人乳脂替代品的脂肪酸组成和甘油三酯种类分析

在酶促合成人乳脂替代品的基础上，目标产物的检测分析对控制目标产物的质量非常重要。目前，产物甘油酯组成的定性/定量分析方法主要有薄层层析法（TLC）、薄层色谱-氢火焰离子化检测器法（TCL-FID）、高效液相色谱-示差检测器法（HPLCRID）等[46]；甘油三酯种类及异构体的检测方法主要有高效液相色谱-质谱法（HPLC-MS）[47]和银离子高效液相色谱法[48]；甘油酯脂肪酸组成的检测方法主要采用气相色谱法（GC）；脂肪酸位置分布的分析方法主要有酶促水解法[30]、格氏化学降解法[49]和13CNMR[50]。Sn-1，3位专一性猪胰脂肪酶催化水解法是常用方法，主要步骤包括脂肪酶水解甘油三酯-水混合液、采用TLC分离甘油一酯、对甘油一酯进行甲酯化和GC检测脂肪酸甲酯。该方法不但耗时，而且酶水解程度不好控制、猪胰脂肪酶对中短碳链脂肪酸（＜C10）和多不饱和脂肪酸和其他碳链脂肪酸的水解能力不同，因此在水解不同脂肪酸组成的油脂如含富含短碳链脂肪酸的牛乳脂和山羊脂等天然油脂及其改性后油脂、富含多不饱和脂肪酸的鱼油存在一定局限性。为解决猪胰脂肪酶水解脂肪的局限性和简化脂肪酸位置分布分析过程，W illiams等[51]对酶促水解法进行改进，即采用sn-1，3位专一性脂肪酶Rhizopus arrhizus水解甘油酯，酶促水解产物不需TLC分离而直接进行甲酯化和GC检测脂肪酸甲酯。此外，化学试剂降解法可以避免因酶法选择性水解甘油酯中脂肪酸的缺陷，但比较耗时。Redden等[52]比较了格氏化学降解法、HPLC法和13C-NMR法分析富含亚麻酸的甘油三酯的sn-2位脂肪酸分析，结果表明了13C-NMR法是较为简单、方便。Silva等[53]运用13CNMR直接分析不同比例的猪油与大豆油混合物以及两种油脂在Lipozyme TL IM催化作用下生成的人乳脂替代品样品的sn-2位和sn-1，3位脂肪酸分布，不需对油脂样品进行酶法水解、薄层层析等处理即了解其脂肪酸位置分布情况。然而，13C-NMR法也有其自身的局限性，虽然可将饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸分开，但不能对不同碳链的饱和脂肪酸以及不同碳链的多不饱和脂肪酸（C18∶2和C18∶3）进一步区分。

人乳脂替代品的主要成分是OPO，但异构体（POO）的存在对OPO的定量有一定的影响。分离和检测甘油三酯异构体通常可采用银离子高效液相色谱法。Lee等[37]采用银离子色谱柱（250mm×4.6mm i.d.，Varian，Netherlands）定量分析由Lipozyme TL IM催化PPP和油酸乙酯合成的人乳脂替代品产物中甘油三酯的种类及其异构体，在设定的色谱条件下，POP、PPO、OPO、POO得到有效的分离，准确定量了反应过程OPO生成量。此外，基于GC检测脂肪酸组成及其位置分布数据也能间接反应人乳脂替代品的OPO含量。理论上，当OPO的纯度为100%时，油酸分布在sn-1，3位的相对含量为66.67%，棕榈酸分布在sn-2位的相对含量为100%。因此，Qin等[32]基于“扣分”原则在GC检测脂肪酸组成及其位置分布的数据基础上，建立了一种评分模型以反映人乳脂替代品中OPO纯度，并通过对比发现运用该模型计算OPO纯度得分与HPLC法测定OPO的含量呈现良好线性关系（R2= 0.94）。

2.5 人乳脂替代品产品评价

由于人乳脂可促进脂肪酸、矿物质、维生素的吸收并减轻便秘，因此，人乳脂被视为“黄金标准”，为人乳脂替代品的开发提供方向以及作为传统婴儿配方奶粉脂肪调配的依据。然而，由前面的介绍可知，人乳脂替代品可以通过不同脂肪酶在不同反应条件下催化不同底物实现，其脂肪酸组成及其位置分布

各异。人乳脂替代品中OPO是主要成分，与人乳脂的脂肪酸组成及其位置分布仍有差距，可通过Matlab优化工具箱中的线性约束优化函数求解OPO型人乳脂替代品与多种植物油物理调配使之脂肪酸组成及结构均与人乳脂相似[13]，经调配后的人乳脂替代品作为奶粉的脂肪来源。目前市场上各种品牌婴儿配方奶粉中脂肪的脂肪酸组成及其位置分布也参差不齐。同时，由于人乳脂脂肪酸种类较多（20多种）及其脂肪酸位置分布复杂，直接、快速地评价婴儿配方奶粉的油脂基或人乳脂替代品的各种脂肪酸含量及其位置分布与人乳脂的相似度有一定的困难。相似度是评价人乳脂替代品的一种重要指标，从复杂的人乳脂脂肪酸数据（如脂肪酸组成及分布、甘油三酯种类等）中以量化、直观的方式评价不同人乳脂替代品与人乳脂的相似度是非常有必要的。然而，人乳脂替代品的评价手段和评估机制相关研究较少。Wang等[9]首次提出了一种基于“扣分”原则的具有直观、量化的评分模型，用于评价不同地域人乳脂的差异、婴儿配方奶粉油脂基与人乳脂的相似度。以人乳脂的总脂肪酸和sn-2位脂肪酸含量为参考标准，基于“扣分”原则，人乳脂替代品的脂肪酸组成及其位置分布指标若与人乳脂的参考值偏离幅度越大，那么相应的指标得分就越低，因此相似度（总分为G=100分）评分模型可表示为若人乳脂替代品的相似度得分越接近满分（100分），则其与人乳脂越相似，反之亦然；并通过评价具有代表性的15种油脂样品验证了该模型建立的可靠性和有效性。Zou等[13]利用Matlab优化OPO与多种植物油（菜籽油、葵花籽油、棕榈仁油、海藻油）混合调配，调配得到人乳脂替代品，运用该模型计算得到相似度为89.2分的人乳脂替代品，与人乳脂非常相似。油脂是以甘油三酯形式被摄入人体并在小肠内分泌的sn-1，3位专一性胰脂肪酶催化水解为甘油一酯和游离脂肪酸。然而婴儿体内的胰脂肪酶活性相对较低，且其对甘油三酯的1和3位上脂肪酸的水解与脂肪酸碳链长短有关。因此，Zou等[54]进一步完善了人乳脂替代品与人乳脂的相似度评价的评价指标，即模型包含了脂肪的脂肪酸组成及其位置分布、甘油三酯组成，相似度评分模型为GFA/sn-2FA/PUFA/TAG=PUFA/TAG）。此外，Wang等[9]建立的基于“扣分”原则的评分模型具有普适性，可以推广到ABA型结构脂（如MLM或LML型结构脂）的评价以反映在酶法合成结构脂过程中ABA的纯度[32]，尤其是在不具备HPLC检测甘油三酯异构体的条件下。

此外，人乳脂替代品的氧化稳定性是保证油脂本身质量的重要因素。人乳脂替代品中不饱和脂肪酸在通常贮存条件下容易吸收氧气而发生氧化反应，使油脂发生变质。其氧化稳定性直接影响到婴儿配方奶粉质量的好坏，而产品品质是与婴儿的健康息息相关的。目前，关于人乳脂替代品的研究主要集中在酶法催化合成人乳脂替代品的优化过程，但关于人乳脂替代品的氧化稳定性的研究较少。Nielsen等[55]通过油脂过氧化值、酸价和挥发性产物三个指标评价了猪油及其酶法改性产品（人乳脂替代品）在60℃避光放置3d的氧化稳定性，结果表明，改性后产品（人乳脂替代品）的氧化性稳定性低于猪油（改性前）的，主要原因是油脂中一些具有抗氧化活性的物质（如生育酚）在人乳脂替代品制备过程和纯化步骤中损失和除去。这一研究结果与其他研究者[56-57]的实验结果是一致的。在酶促合成人乳脂替代品过程以及后续的精炼过程都可使油脂本身含有的生育酚等天然抗氧化剂损失，导致在人乳脂替代品在后期的贮存过程中氧化稳定性较差。为了防止油脂在酶促合成结构脂特别是酶法合成富含多不饱和脂肪（如：C18∶2n-6、C18∶3n-3、DHA和AA）的结构脂过程中多不饱和脂肪酸发生氧化，向反应体系加入一定量的抗氧化剂（生育酚）以及在结构脂产品中添加一定浓度的抗氧化剂是防止脂肪酸在酶促反应过程和贮存过程发生氧化的有效手段[58]，从而有效改善油脂氧化稳定性。此外，人乳脂替代品的氧化稳定性在婴儿配方奶粉加工与贮藏过程中也容易受到加工工艺以及奶粉配方中其他营养素（如铜、铁金属离子）的影响。黄兴旺[59]详细考察了奶粉生产工艺、抗氧化剂、矿物质添加方式等对婴儿配方奶粉中脂肪氧化稳定性的研究；该研究有助于掌握婴儿配方奶粉加工与贮藏过程中脂肪的氧化稳定性变化规律，对保障配方奶粉的品质与安全及指导配方奶粉生产具有重要意义。

3 展望

随着人们生活质量的不断提高，哺乳期母亲对婴儿配方奶粉的质量非常重视。在日益增长的高品质婴儿配方奶粉需求与供给的矛盾下，人乳脂替代品，作为婴儿配方奶粉的重要配料，在中国具有重要的市场潜力。本文对人乳脂替代品的酶法合成、检测分析方法和相似度评价和氧化稳定性等进行了介绍和总结。基于目前的研究现状与进展，人乳脂替代品的研究在以下几个方面仍需进一步研究：a.探索具有高度的位置专一性、脂肪酸选择性和热稳定性的廉价新型脂肪酶；b.深入研究脂肪酶催化过程界面化学等方面，从而提高脂肪酶的催化效率；c.虽然多步酶法合成人乳脂替代品的OPO纯度比一步酶法合成的纯度高，但这两种方法得到的OPO甘油酯产品最终还需与多种植物油按一定比例调配而形成最终的人乳脂替代品并添加到配方奶粉中，使配方奶粉脂肪中的脂肪酸组成与人乳脂的相接近。因此，由不同OPO纯度甘油酯与多种植物油调配而成的两种人乳脂替代品的氧化稳定性、营养和脂质代谢等方面是否存在显著差别需要进行全面和综合的评估。

目前，可提供人乳脂替代品产品的仅有两家公司（荷兰Unilever公司和以色列AAK公司），其中最具有代表性的是由Unilever公司生产的产品BetapolTM（主要成分OPO）。在2008年，中国卫生部批准OPO甘油酯添加到婴儿配方奶粉中。然而，国内还没有该类人乳脂替代品的生产和销售。随着酶工程技术和相

关化工工程技术的发展，相信国内相关企业很快建立具有自主知识产权的人乳脂替代品的生产工艺。

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Research progress in enzymatic production and evaluation ofhuman milk fat substitutes

ZHONG Jin-feng1，QIN Xiao-li1，*，WANG Yong-hua2，*
（1.College of Food Sciences，Southwest University，Chongqing 400715，China；2.College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China）

The breastfeeding rate is generally low in China and some other developing countries due to economic，social and personal factors. Human milk fat has a high content of palmitic acid at the sn-2 position of theglycerol backbone compared with ruminant milk fat and common vegetable oils. Such a unique structure helpsthe simultaneous absorption of fatty acids in the gut lumen of the infant and the loss of calcium through thefeces. As an important ingredient in infant formula，human milk fat substitutes with high similarity to human milkfat have great potential in industrial applications. Human milk fat substitutes can be synthesized using sn-1，3specific lipases due to mild reaction conditions，high sn-1，3-regioselectivity and fatty acid specificity of theselipases. In this article，the definition and enzymatic synthesis of human milk fat substitutes were reviewed，andstudy on human milk fat substitutes in the future was pointed out. Particular attention was paid to choice ofnatural oils and acyl donors，lipase screening，synthesis methods and techniques，analytical procedures，similarity evaluation and oxidation stability.

human milk fat substitute；lipase；similarity；interesterification；evaluation

TS201.1

：A

：1002-0306（2014）16-0377-08

10.13386/j.issn1002-0306.2014.16.074

2013－11－08 *通讯联系人

钟金锋（1984-），男，博士，讲师，研究方向：食品营养化学、碳水化合物改性及其过程的优化控制。

中国博士后科学基金（2013M531927）；中央高校基本科研业务费专项（XDJK2013B034，SWU113036，XDJK2014B019）；重庆市基础与前沿研究计划（cstc2013jcyjA80024）。