苹果多酚的固相萃取纯化研究

贺金娜，曹 栋，*，史苏佳

（1.江南大学食品学院，江苏无锡214122；2.江南大学理学院，江苏无锡214122）

苹果多酚的固相萃取纯化研究

贺金娜1，曹 栋1，*，史苏佳2

（1.江南大学食品学院，江苏无锡214122；2.江南大学理学院，江苏无锡214122）

研究了用固相萃取法纯化，高效液相色谱法测定苹果中多酚类物质的方法。以苹果冻干粉为原料，加标回收率为指标，从四种固相萃取小柱中筛选出分离效果较好的Waters Oasis HLB固相萃取小柱对提取液进行预处理。以phenomenex Luna C18色谱柱（150mm×4.6mm，5μm）为固定相，以0.1%的甲酸溶液（v/v）和乙腈为流动相梯度洗脱，紫外双波长扫描280、320nm条件下检测。结果：检测出七种中性多酚，三种酸性多酚。加标回收率为95%～104%，相对标准偏差均小于2.2%。结论：该方法快速、灵敏、简便、准确，杂质干扰少，10种多酚类物质峰分离度好。

高效液相色谱，固相萃取，苹果，多酚

苹果多酚是苹果中具有苯环并结合多个羟基的化学物质的总称。研究表明，苹果多酚具有清除自由基、抗氧化、预防癌症、降血压、预防心脏病、抗龋齿、抗过敏、抗病毒等80多种生理功能，因此在医药、食品、日用化工等领域具有广阔的应用前景[1]。

苹果中的多酚物质主要包括黄烷-3-醇类、黄酮醇类、羟基苯甲酸类、二氢查尔酮类、花色苷类等五类[2-4]。苹果中多酚类物质的测定方法主要采用高效液相色谱法，但有机溶剂萃取得到的粗提物中苹果多酚的纯度较低，影响检测结果。传统的液相色谱法样品前处理方法，费时费力，纯化效果不理想，而且过程中容易造成多酚类物质的损失。固相萃取技术是近年来兴起的一项广泛应用的样品前处理技术[5-6]，通过选择不同的固定相与流动相进行多种搭配组合，实现对目标组分与杂质之间的高选择性分离。

本研究从Strata C18-E、Waters Oasis HLB、DIKMA ProElut PWA、Strata-X-AW四种固相萃取小柱中筛选出预处理效果最好的固相萃取小柱对苹果多酚提取液进行纯化，高效液相色谱方法分离测定苹果多酚，取得满意结果。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

（+）-儿茶素、对香豆酸、鞣花酸、咖啡酸、异槲皮素、阿魏酸 购于Sigma公司；根皮素、根皮苷、（-）-表儿茶素、绿原酸、没食子酸、槲皮素、槲皮苷、芦丁、原花青素B 购于北京北纳创联生物技术研究院；甲醇、乙腈、甲酸、氨水、醋酸铵 均为色谱纯；乙醇、乙酸乙酯、盐酸、氢氧化钠 均为分析纯；红富士苹果

市售。

Waters 1525高效液相色谱仪、Waters 2489紫外检测器 Waters公司；phenomenex Luna C18色谱柱（150×4.6mm，5μm） Phenomenex公司；日本日立CR21GШ高速低温冷冻离心机 日立公司；Forma-86C超低温冰箱 美国Thermo公司；LGJ-18型冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂；ND100-1氮气吹干仪 杭州瑞诚仪器有限公司；JJ-2组织捣碎匀浆机 常州国华电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制 准确称取儿茶素、表儿茶素、芦丁、异槲皮素、鞣花酸、根皮苷、槲皮素、槲皮苷、根皮素、原花青素B2、没食子酸、绿原酸、对香豆酸、阿魏酸、咖啡酸各10mg，用甲醇分别溶解并定容至10m L，得到1000μg/m L标准品溶液。分别移取儿茶素2.5m L、表儿茶素2.5m L、芦丁2.5m L、异槲皮素7.5m L、根皮素0.25m L、根皮苷0.25m L、槲皮素1.25m L、槲皮苷0.75m L、原花青素B20.25m L混合定容至25m L，得到中性多酚混合标准溶液。分别移取鞣花酸2.5m L、没食子酸0.625m L、绿原酸0.75m L、对香豆酸0.625m L、阿魏酸0.5m L、咖啡酸0.25m L混合定容至25m L，得到酸性多酚混合标准溶液。标准品溶液4℃冰箱中冷藏备用。

1.2.2 样品的制备 将新鲜的苹果去核切块，按100m L NaF（5g/L）对应1kg水果的配比将NaF水溶液加入其中[7]，而后加入到组织捣碎匀浆机中打浆1m in，将苹果浆置于-72℃下冷冻一夜，之后进行冷冻干燥。干燥后的苹果粉末真空包装放置在-18℃下保藏待用。

准确称取10g苹果冻干粉两份分别置于两个250m L平底烧瓶中——加标瓶和空白瓶，加标瓶中加入中性多酚混合标准溶液、酸性多酚混合标准溶液各5m L，空白瓶中都不加。两瓶中各加入100m L 70%的乙醇，在60℃超声下浸提20m in，过滤得到苹果渣，重复一次上述浸提步骤。分别合并浸提液后冷却，将冷却后的浸提液在9000r/min下离心10min，取上清液备用。

1.2.3 色谱条件 phenomenex Luna C18色谱柱（150× 4.6mm，5μm）；柱温：30℃；流动相：A为0.1%甲酸溶液，B为乙腈，线性梯度洗脱，0～5min：流动相A=85%，5～25m in：流动相A：85%～50%，25～35m in：流动相A：50%～0%，35～40min：流动相A=0%，40～41min：流动相A：0%～85%，41～45m in：流动相A=85%。流速：中性多酚1m L/m in，酸性多酚0.8m L/m in；进样量：10μL；检测波长：中性多酚280nm，酸性多酚320nm。

1.2.4 标准曲线和检测限 在已经确定的色谱条件下，分别将不同浓度梯度的各种中性多酚的标准溶液：儿茶素、表儿茶素、原花青素B2、槲皮素、异槲皮素、槲皮苷、根皮素、根皮苷、芦丁，以及不同浓度梯度的各种酸性多酚的标准溶液：绿原酸、咖啡酸、没食子酸、鞣花酸、阿魏酸、对香豆酸进行HPLC分析，根据标准物质的浓度和峰面积的关系进行线性回归，同时根据信燥比S/N=3，测得各组分最低检测浓度。

1.2.5 固相萃取小柱筛选 从加标瓶、空白瓶中各取出四份相同体积的苹果多酚提取液进行纯化处理，方法见表1。得到八种洗脱液氮吹至干。分别进行如下操作：加入蒸馏水20m L溶解，用1mol/L的NaOH溶液调节pH至7.0，转移到分液漏斗中，加入20m L乙酸乙酯，摇动10min，分离出酯相和水相，酯相氮吹至干溶于1m L甲醇中，此为中性多酚。水相用6mol/L的HCl溶液调节pH至2.0，再加入20m L乙酸乙酯萃取。分离出酯相和水相，酯相氮吹至干，重新溶解于1m L的甲醇中，此为酸性多酚。在已经确定的色谱条件下，对于以上操作得到的16个多酚样品进行HPLC分析。加标样扣除相对应空白样基准后得到加入标准的测出量，加入标准的测出量除以标准加入量计算加标回收率，平行测定三次取平均值，计算标准偏差和相对标准偏差。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线和检测限

按1.2.4方法得到标准曲线和检测限，结果见表2。

2.2 固相萃取小柱筛选

按1.2.5方法得到四种固相萃取小柱对于各种多酚的加标回收率，结果见表3、表4。

由表3、表4结果可以看出，对于中性多酚而言，Strata C18-E和Waters Oasis HLB回收率要远高于DIKMA ProElut PWA和Strata-X-AW，Strata C18-E和Waters Oasis HLB回收率结果不相上下。而对于酸性多酚而言，DIKMA ProElut PWA和Strata-X-AW的回收率则高于前面两种小柱，Strata C18-E和Waters Oasis HLB比较的话，前者对于酸性多酚的回收率要略低一点。综合考虑中性多酚和酸性多酚两大类，Waters Oasis HLB固相萃取小柱对于苹果多酚的处理效果更好，故选择Waters Oasis HLB固相萃取小柱作为苹果多酚粗提取液纯化处理柱。

2.3 Waters Oasis HLB固相萃取小柱纯化效果

酸性多酚和中性多酚的标准溶液的色谱图见图1。

未加标原提取液经真空浓缩至干，用甲醇重新溶解后的色谱图见图2。未加标提取液经Waters Oasis HLB固相萃取小柱预处理后的色谱图见图3。对比图2和图3可知，未经处理的苹果多酚提取液的色谱图中杂质峰很多，无法确定有哪些多酚物质。固相萃取小柱处理之后，大部分杂质峰不再出现，不会干扰检测。对比图3（A）与图1（A），可知苹果中中性多酚有表儿茶素、原花青素B2、芦丁、异槲皮素、槲皮苷、根皮苷、根皮素。对比图3（B）与图1（B），可知苹果中酸性多酚有咖啡酸、绿原酸、对香豆酸。

表1 四种固相萃取小柱处理样品方法Table 1 Sample processingmethod of four kinds of solid phase extractionminicolumn

表2 回归方程、相关系数及检测限Table 2 Regression equation,correlation coefficientand detection limit

图1 多酚标准溶液HPLC图谱Fig.1 Chromatogram of polyphenols standards注：A：中性多酚标准溶液；B：酸性多酚标准溶液。

图2 未经固相萃取样品HPLC图谱Fig.2 Chromatogram of samplewithout solid phase extraction processing

3 结论

3.1 本实验采用固相萃取处理样品，考察了不同种类固相萃取小柱的预处理效果。从中筛选出预处理效果较好的Waters Oasis HLB作为苹果多酚纯化柱。采用高效液相色谱法0.1%甲酸水溶液（v/v）-乙腈梯度洗脱。中性多酚、酸性多酚分别进行分析，两类多酚都得到了很好的分离。本方法简单快速、结果可

靠，在一定程度上为苹果中多酚类物质研究提供了依据。

表3 中性多酚回收率（%）Table 3 Recoverys of neutral polyphenols（%）

表4 酸性多酚回收率（%）Table 4 Recoverys of acidic polyphenols（%）

图3 经固相萃取样品HPLC图谱Fig.3 Chromatogram of sampleswith solid phase extraction processing

3.2 红富士苹果中主要的多酚物质为原花青素B2、表儿茶素、芦丁、异槲皮素、槲皮苷、根皮苷、根皮素、绿原酸、咖啡酸、对香豆酸。

[1]杨薇，张晓旭，李景明.苹果多酚功能及其作用机理的研究进展[J].食品研究与开发，2012，33（1）：193-196.

[2]庞伟，徐抗震，宋纪蓉.苹果多酚结构及褐变研究进展[J].四川食品与发酵，2006，42（2）：9-13.

[3]Chagne D，Krieger C，Rassam M，et al.QTL and candidate gene mapping for polyphenolic composition in apple fruit[J]. BMC Plant Biology，2012，12（1）：12-27.

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[5]周强，杨国荣，杨亚玲，等.微柱高效液相色谱法测定苦荞中芦丁的研究[J].云南化工，2004，31（1）：28-29.

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Study on solid phase extraction in the purification of apple polyphenols

HE Jin-na1，CAO Dong1，*，SHISu-jia2
（1.School of Food Science，Jiangnan University，Wuxi214122，China；2.School of Science，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

A method of solid phase extraction combined with HPLC determination of polyphenols in apple wasstudied. Taking apple lyophilized powder as raw material ，recovery of the polyphenols as the measureindicators，Waters Oasis HLB was screened out from four kinds of solid phase minicolumns to purify the appleextract. Gradient eluation was carried out on the chromatographic column phenomenex Luna C18（150mm×4.6mm，5μm）with the mobile phase consisted of 0.1% formic acid solution（v/v） and acetonitrile. Under theseconditions，the components of apple polyphenols can be perfectly separated. An UV-detector was used forrecording the chromatographic peaks of the apple polyphenols at 280nm and 320nm. The results showed thatpolyphenols in apple were seven kinds of neutral polyphenols and three kinds of acidic polyphenols，therecovery of the polyphenols was in the range of 95%～104% and RSD were lower than 2.2%. This method wasrapid，sensitive，simple，accurate and less impurity interference，and ten kinds of polyphenols peaks wereseparated well.

high performance liquid chromatography；solid phase extraction；apple；polyphenols

TS201.1

：B

：1002-0306（2014）16-0290-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.16.055

2013-12-03 *通讯联系人

贺金娜（1986-），女，硕士研究生，主要从事苹果多酚方面的研究。