坛紫菜水溶膳食纤维二次正交旋转组合法提取工艺的优化及其抗油脂氧化研究

赖蓓蕾，金寒冰，方 丽，吴祥庭

（温州大学生命与环境科学学院，浙江温州325027）

坛紫菜水溶膳食纤维二次正交旋转组合法提取工艺的优化及其抗油脂氧化研究

赖蓓蕾，金寒冰，方 丽，吴祥庭*

（温州大学生命与环境科学学院，浙江温州325027）

以坛紫菜为原料，采用复合酶法提取水溶性膳食纤维，以猪油、菜油为材料考察其抗油脂氧化作用。在单因素实验基础上，采用二次正交旋转组合设计法对坛紫菜水溶性膳食纤维提取工艺进行优化，建立纤维素酶添加量（X1）、酶解pH（X2）、酶解温度（X3）和酶解时间（X4）等4个因素与水溶性膳食纤维提取率之间的回归模型。结果表明：纤维素酶法提取的最佳工艺参数为酶添加量1.1%、酶解pH5.8、酶解温度55℃和酶解时间1.5h，在此条件下坛紫菜水溶性膳食纤维提取率为9.80%±0.12%；膨胀力为1.97mL/g，持水力为276%，坛紫菜水溶性膳食纤维能明显减缓油脂POV值升高趋势，且具有一定的时间和浓度依赖性，显示坛紫菜可溶性膳食纤维具有一定的抗油脂氧化能力。

坛紫菜，水溶性膳食纤维，优化，二次回归正交旋转设计，抗油脂氧化

紫菜[1]是世界上经济价值最高的大型海藻之一，其中到2006年底中国坛紫菜养殖面积接近1.7万公顷，年产干紫菜达到4万吨，坛紫菜（Porpyra haitanensis）是中国特有栽培品种，属红藻门、红毛菜科、紫菜属，主要养殖于浙江、福建和广东等长江以南沿海地区。坛紫菜主要作为菜肴，为一种低脂肪（0.5%～2.09%）、高蛋白（34.48%～37.21%）、富含膳食纤维（35%）和多种矿物质且美味的天然食品[2]，目前有提取薯渣[3]、玉米皮[4]、苹果皮[5]和花生壳中[6]的水溶性膳食纤维的研究发展，尚未有提取坛紫菜膳食纤维的研究报道。膳食纤维（dietary fiber，DF）按溶解性分为水溶性膳食纤维（soluble dietary fiber，SDF）和不溶性膳食纤维（insoluble dietary fiber，IDF）。SDF在预防糖尿病、心血管疾病，降低胆固醇[7-11]和清除外源有害物质等方面具有比IDF更强的生理功能。目前，SDF提取方法主要有化学法（酸法和碱法）和酶法[12]，酶法具有提取条件温和、操作简便、副产物少和成本较低等优点。本实验在单因素的基础上采用二次正交旋转组合法优化纤维素酶提取SDF工艺，并对提取物的抗油脂氧化性[13-14]进行研究，旨在为制备坛紫菜膳食纤维的功能性食品提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

坛紫菜 农贸市场；纤维素酶（规格＞30U/mg）、中性蛋白酶（酶活力＞13万U/mg） 上海蓝季科技发展有限公司；淀粉酶（酶活力≥2000U/g） 国药集团化学试剂有限公司；铁氰化钾、三氯化铁、三氯乙酸、抗坏血酸、碘、碘化钾、氯仿、冰醋酸、淀粉、柠檬酸 西陇化工股份有限公司；BHT 美国Sigma公司。

HH-S型数显水浴锅 郑州长城科工贸有限公司；SZCL-2B型数显智能控温磁力搅拌器 郑州长城科工贸有限公司；101-2型微电脑智能化控制恒温干燥箱 宁波莱福科技有限公司；UV-722型可见分光光度计 上海欣茂仪器有限公司；BS-223S型电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；TDL60B台式离心机 上海安亭科学仪器厂；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵 郑州长城科技工贸有限公司；WF型万能粉碎机 江阴市康和机械制造有限公司。

1.2 水溶性膳食纤维提取

1.2.1 工艺流程[6]坛紫菜→粉碎→过筛→紫菜粉末→混合酶酶解[15]→灭酶→纤维素酶酶解→灭酶→离心→抽滤→滤液→70℃减压浓缩→醇沉→抽滤→滤渣→60℃真空干燥→水溶性膳食纤维。

1.2.2 工艺要点

1.2.2.1 原料预处理 坛紫菜，万能粉碎机粉碎后过50目筛。

1.2.2.2 混合酶酶解 调解pH6.0、温度65℃、料液比1∶15[以坛紫菜/水（g/m L）计]，分别添加质量分数0.6%木瓜蛋白酶、淀粉酶（比例1∶4）酶解2h，去除坛紫菜中的蛋白质和淀粉。

1.2.2.3 纤维素酶酶解 调节料液比、pH、温度、纤

维素酶添加量、反应时间进行酶解。

1.2.2.4 灭酶 煮沸灭酶10min。

1.2.2.5 离心 设置转速4000r/m in、时间30m in进行离心分离。

1.2.2.6 醇沉 搅拌的同时向浓缩液中加入4倍体积的95%乙醇，4℃冰箱中静置12h。

1.2.3 影响水溶性膳食纤维提取率的单因素实验 准确称取坛紫菜粉末1.0g，放入100m L烧杯中，选取影响SDF提取率的纤维素酶添加量、酶解pH、酶解温度、酶解时间和料液比5个因素进行研究，按工艺流程进行处理得水溶性膳食纤维，测定某一因素时，其他因素固定为基本条件；各单因素实验所选择的基本条件为：1.00%酶加量，酶解pH 5.0，酶解温度50℃，酶解时间1.5h，料液比1∶15（g/m L），计算SDF提取率。

SDF提取率（%）=（M1/M2）×100

式中：M1为提取的SDF质量（g）；M2原料质量（g）。

1.2.4 二次回归正交旋转组合实验 根据中心组合实验[16]设计原理，结合单因素实验分析结果，选取对SDF提取率影响较大的四个因素：加酶量（X1）、酶解pH（X2）、酶解温度（X3）和酶解时间（X4），以SDF提取率为（Y）值[17]进行二次回归正交旋转组合实验如表1。

1.2.5 坛紫菜SDF持水力测定[12]称取1g坛紫菜SDF置于烧杯，加50m L蒸馏水，室温下搅拌24h，在转速3500r/min下离心30m in，除去上清液，再称样品湿质。

表1 二次回归正交旋转组合实验设计表Table 1 Quadratic regression rotational combinational design table

持水力（%）＝[样品湿质量（g）-样品干质量（g）]/样品干质量（g）×100

1.2.6 坛紫菜SDF膨胀力测定 称取1g坛紫菜SDF放入量筒，加25m L水，振荡均匀后在室温放置24h。观察样品在量筒中自由膨胀体积（m L），折算成每克干重的膨胀体积（m L）来表示。

膨胀力（m L/g）＝[膨胀后纤维体积（m L）-干体积（m L）]/样品干质量（g）

1.2.7 坛紫菜水溶性膳食纤维抗油脂能力测定

1.2.7.1 标准曲线的绘制 称取2.5381g碘和6.64g碘化钾放入500m L烧杯中，加蒸馏水溶解，转移至1000m L棕色容量瓶中，用蒸馏水定容，摇匀。分别取1、2、3、4、5、6、7、8、9、10m L 0.001mol/L碘-碘化钾溶液定容到100m L容量瓶中，取10根10m L的试管，分别加入上述不同浓度的碘-碘化钾，并加入2m L氯仿-冰醋酸（体积比2∶3）和1m L 1%（W%）淀粉液定容至10m L容量瓶，取上清液4m L在585nm测吸光值。得碘含量（X）与吸光度（Y）的线性回归方程式为Y= 0.0546X-0.0629，相关系数R2=0.9946，通过公式得出样品的POV值。

1.2.7.2 油脂POV值测定 取30g油脂（猪油或植物油），加坛紫菜SDF、VC、BHT和柠檬酸0.6g于100m L烧杯中，放入65℃烘箱中，每隔48h取样测定，测定油脂POV值方法：称油样0.6g放入具塞试管，加入2m L冰醋酸-氯仿液，摇匀溶解后加入1m L 1.0%KI溶液，盖塞摇30s后在暗处反应3m in，再加入1m L 1%可溶性淀粉液，再按标准曲线方法，根据吸光度计算碘生成量，计算样品POV值。

式中：W为油脂质量30g。

1.2.8 数据分析 数据处理采用SAS软件对二次回归正交旋转组合实验结果进行处理[17]。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

分别选择加酶量、酶解pH、酶解温度、酶解时间和料液比为因素，用酶解法提取坛紫菜总水溶性膳食纤维结果如下。

2.1.1 不同的加酶量对坛紫菜SDF提取率的影响 由图1可以看出，加酶量在1.00%时SDF提取率达到最

大值9.34%，因为纤维素酶作用于IDF大分子组分连接键可使IDF降解为小分子，溶解度增大，使部分IDF转变成SDF，从而使SDF提取率增加；但是随着加酶量的继续增大，纤维素酶可进一步作用于SDF，将其降解为相对分子质量更小的低聚糖甚至单糖。由于聚合度低，在乙醇醇沉的过程中这些组分溶于乙醇而不能被沉淀出来。

图1 不同的加酶量对坛紫菜SDF提取率的影响Fig.1 Effectof the dosage of alcalase on SDF extraction rate of porphyra haitanensis

2.1.2 不同酶解pH对坛紫菜SDF提取率的影响 由图2可以看出，pH在5.0时SDF提取率达到最大值9.36%，原因是纤维素酶的最活跃pH为5.0，所以pH 5.0时的提取率最大。

图2 不同酶解pH对坛紫菜SDF提取率的影响Fig.2 Effect of enzymolysis pH on SDF extraction rate of porphyra haitanensis

2.1.3 不同酶解温度对坛紫菜SDF提取率的影响 由图3可以看出，酶解温度在50℃时SDF提取率达到最大值9.73%，原因是催化、水解反应速度受温度影响较大，温度越高则反应速度越快，纤维素酶属于蛋白质，温度过高会使纤维素酶变性而失去水解活性，在较低温度时，水解反应速度会随着温度升高而加快。纤维素酶的使用温度范围为30～70℃，在30～50℃范围内，提取率逐渐增加，高于50℃反而减慢，反应温度为50℃时，SDF达到最高。

图3 不同酶解温度对坛紫菜SDF提取率的影响Fig.3 Effectof enzymolysis temperatureon SDF extraction rate of porphyra haitanensis

2.1.4 不同酶解时间对坛紫菜SDF提取率的影响 由图4可知，酶解时间在1.5h时SDF提取率逐渐达到最大值9.64%，酶解时间越长，底物与酶作用的时间就越长，则底物被酶水解的就越多，酶解时间过短，没有充分反应，SDF溶出较少，如果酶解时间过长，会导致SDF被纤维素酶裂解为分子质量更小的低聚糖甚至单糖，而这些低聚糖和单糖因为溶于乙醇不能被醇沉从而降低SDF的产量。

图4 不同酶解时间对坛紫菜SDF提取率的影响Fig.4 Effectof enzymolysis time on SDF extraction rate of porphyra haitanensis

2.1.5 不同料液比对坛紫菜SDF提取率的影响 由图5可知，料液比为1∶20g/m L时SDF提取率达到最大值9.38%，当溶剂增大时水溶性膳食纤维溶出量增多，达到饱和后水溶性膳食纤维的SDF增加不多，此外溶剂用水量增多会增加浓缩负荷。

图5 不同料液比对坛紫菜SDF提取率的影响Fig.5 Effectof ratio of liquid to solid on SDF extraction rate of porphyra haitanensis

2.2 二次正交旋转组合实验的结果与分析

坛紫菜水溶性膳食纤维提取优化的二次回归正交旋转实验组合及结果见表2。

根据实验结果，采用SAS软件对所得数据进行回归分析，回归分析结果见表3、表4，其四元二次回归

预测模型：

表2 二次回归正交旋转组合分析实验及结果Table 2 Analysis of the results of quadratic regressionrotational combinational desig

从表3中可以看出，用以上的四元二次回归方程描述因子回归方差分析得p值小于0.01，说明实验结果分析所得到的四元二次回归方程回归高度显著，同时由于校正决定系数R2=0.8523，这说明运用这种实验方法来进行紫菜水溶性膳食纤维提取条件优化是可靠的，模型拟合度强，可以使用该四元二次回归预测模型方程代替原来真实的实验点进行数据分析。

表3 模型回归方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

由表4所示，模型回归系数显著性检验结果中p＜0.01的项X12、X22、X32和X42均显著，说明加酶量、酶解pH、酶解温度、酶解时间这四个因素的二次项影响显著，四因素对紫菜水溶性膳食纤维提取效果的影响较大。

根据回归作出响应面图6，两个变量固定在其各自的零级，即中心值处，在另外两个连续变量下得到了SDF的提取率，分析所得预测值被限制在最小的椭圆内。由图6（a）分析，当X3=0，X4=0时，随着加酶量在0.6%～1.084%范围内不断增大，pH从3到5.821，提取率到达最大值后，加酶量继续增加到1.4，pH增加到7，提取率反而减小；当X2=0，X4=0，如图6（b）所示，随

着加酶量0.6%～1.084%和酶解温度30～55.212℃，SDF的提取率达到最大，然后加酶量1.084%～1.4%和酶解温度55.212～70℃，SDF的提取率又呈现下降趋势；图6（c）显示，当X2=0，X3=0时，随着加酶量0.6～1.084%和酶解时间0.5～1.477h，SDF的提取率达到最大，然后加酶量1.084%～1.4%和酶解时间1.477～2.5h，SDF的提取率又呈现下降趋势；在图6（d）中，当X1=0，X4=0时，随着pH3～5.821和酶解温度30～55.212℃，SDF的提取率达到最大，然后pH 5.821～7和酶解温度55.212～70℃，SDF的提取率又呈现下降趋势；如图6（e）所示，X1，X3同时为0时，随着pH 3～5.821和酶解时间0.5～1.477h，SDF的提取率达到最大，然后pH5.821～7和酶解时间1.477～2.5h，SDF的提取率又呈现下降趋势；图6（f）显示在X1=0，X2=0时，随着酶解温度30～55.212℃和酶解时间0.5～1.477h，SDF的提取率达到最大，然后酶解温度55.212～70℃和酶解时间1.477～2.5h，SDF的提取率又呈现下降趋势，最高SDF提取率为9.8154%。

表4 模型回归系数显著性检验和结果Table 4 Significant regression coefficient testand the results

图6 三维响应面变量对响应值Y影响Fig.6 Response surface plots（3-D）showing the Effectof variables on the response Y

2.3 坛紫菜水溶性膳食纤维提取最佳纯化条件验证

在选取的各因素范围内，根据回归模型通过SAS软件分析得出，SDF提取的最佳浸提条件为：料液比达1∶20g/m L、加酶量1.1%、酶解pH 5.8、酶解温度55℃、酶解时间1.5h，坛紫菜膳食纤维预测最大提取率为9.8154%，重复实验3次，坛紫菜膳食纤维的提取率为9.80%±0.12%，与预测值基本一致，说明SAS软件分析得出的四元二次回归与实际实验得到的原始数据拟合状况良好，同时也说明二次回归正交旋转组合实验法适用于对坛紫菜水溶性膳食纤维的提取纯化工艺进行回归分析和参数优化。

2.4 水溶性膳食纤维持水力测定结果

通过测定，坛紫菜可溶性膳食纤维的持水力为276%，可见坛紫菜SDF的持水力较高，适宜作为食物纤维。

2.5 水溶性膳食纤维膨胀力测定结果

通过测定，坛紫菜SDF膨胀力为1.97m L/g，可见具有良好的保水能力，人类食用后能增加粪便体积，软化粪便，促使粪便排出，减轻毒素。

2.6 水溶性膳食纤维在油脂中抗氧化作用（与其他抗氧化剂比较）

由图7（a）可知水溶性膳食纤维、VC、柠檬酸和BHT对猪油都有抗氧化性，100h前水溶性膳食纤维对猪油的抗氧化能力比VC和BHT的要好，比柠檬酸的要差，100h后水溶性膳食纤维对猪油的抗氧化能力有所下降。由图7（b）可知，水溶性膳食纤维、VC、柠檬酸和BHT对植物油都有抗氧化性，150h前水溶性膳食纤维对植物油的抗氧化能力较弱，150h后水溶性膳食纤维对植物油的抗氧化能力比VC、柠檬酸和BHT好。在油脂氧化中，铜、铁等金属离子是促进氧化的催化剂，油脂抗氧化剂如BHA柠檬酸、BHT、VC等螯合了这些离子，或者本身能与氧结合具有抗氧化性，水溶性膳食纤维抑制菜油的氧化酸败，表现出较好的抗氧化活性。因此水溶性膳食纤维可能与金属离子螯合，从而起到抗氧化的作用。

图7 不同抗氧化剂对油脂POV的影响Fig.7 Effectof different antioxidants on lipid POV

3 结论

通过单因素实验最终确定了影响水溶性膳食纤维提取率的主要的四个因素为加酶量、pH、酶解温度和酶解时间。在单因素的基础上通过二次正交旋转组合设计优化提取条件，其最佳提取条件为：料液比1∶20g/m L、加酶量1.1%、酶解pH 5.8、酶解温度55℃、酶解时间1.5h，坛紫菜膳食纤维提取率为9.80%±0.12%；坛紫菜中可溶性膳食纤维的持水率为276%，膨胀力为1.97m L/g。实验表明，坛紫菜水溶性膳食纤维对油脂具有抗氧化能力，有待进一步开发成天然抗氧化剂，为人类造福。

[1]陈必链，林跃鑫，黄键.坛紫菜的营养评价[J].中国海洋药物，2001（2）：51-53.

[2]谢程亮，黄健，孙彬，等.坛紫菜（红藻门，红毛菜纲）化学成分分析[J].中国海洋药物杂志，2009，28（1）：29-35.

[3]陆红佳，郑龙辉，刘雄.超声波辅助酶结合碱法提取薯渣纤维素的工艺研究[J].食品工艺科技，2012，33（1）：234-237.

[4]侯传伟，魏书信，王安建.双酶改性制备玉米皮水溶性膳食纤维的工艺研究[J].食品科学，2009，30（22）：119-121.

[5]牟建楼，王颉，孙剑锋.响应面法优化纤维素酶提取苹果渣中水溶性膳食纤维[J].食品科学，2012，33（8）：95-98.

[6]雨丽娜，杨庆利，禹山林，等.花生壳水溶性膳食纤维酶法提取及抗氧化研究[J].食品研究与开发，2010，31（10）：158-163.

[7]钱晓婕，陈舜胜，付杰.坛紫菜中藻胆蛋白的提取及其抗氧化活性研究[J].中国海洋药物杂志，2008，27（2）：42-45.

[8]SEIDNER D L，LASHNER B A，BRZEZINSKIA，et al.An oral supplement enriched with fish oil，soluble fiber，and antioxidants for corticosteroid sparing in ulcerative colitis：A randomized，controlled trial[J].Clinical Gastroenterology and Hepatology，2005，3（4）：358-369.

[9]王勇杰，姚如永，张海平，等.坛紫菜硫酸多糖对60Co辐射引起的小鼠体内氧化应激的作用研究[J].中国海洋药物杂志，2004，23（6）：32-35.

[10]韩俊娟，木泰华，张柏林．膳食纤维生理功能的研究现状[J]．食品科技，2008，33（6）：243-245．

[11]ZHANG Zhongshan，ZHANG Quanbin，WANG Jing，et al. Chemicalmodi cation and in uence of function groups on the in vitro-antioxidantactivitiesofporphyran from Porphyra haitanensis [J].Carbohydrate Polymers，2010，79：290-295.

[12]N Ozsoy，A Can，R Yanardag，etal.Antioxidantactivity of Smilax excelsa L.leaf extracts[J].Food Chemistry，2008，110：571-583.

[13]LIM SN，CHEUNG PC K，OOIV E C，et al.Evaluation of antioxidative activity ofextracts from a brown seaweed，Sargassum siliquastrum[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50：3862-3866.

[14]李颖畅，马春颖，孟宪军，等.蓝莓花色苷提取物抗油脂氧化能力的研究[J].中国粮油学报，2010，25（2）：92-95.

[15]许晖，孙兰萍，张斌.酶解法制备米糠膳食纤维[J].中国粮油学报，2007，22（4）：117-120.

[16]王钦德，杨坚．食品实验设计与统计分析[M]．北京：中国农业大学出版社，2010：297-348

[17]朱世武．SAS编程技术教程[M]．北京：清华大学出版社，2007．

Optimizing extraction of soluble dietary fiber from porphyra haitanensisthrough quadratic regression orthogonal design and its oil antioxidation

LAIPei-lei，JIN Han-bing，FANG Li，WU Xiang-ting*
（School of Life&Environmental Science，Wenzhou University，Wenzhou 325027，China）

Taking porphyra haitanensis as raw material，the composite enzymatic extraction technology was used to extract soluble dietary fiber，the antioxygenic activity of the soluble dietary fiber of porphyra haitanensis for lard and vegetable oilwas study.Based on single factor experiments，extraction conditions of soluble dietary fiber in porphyra haitanensis were optimized through quadratic regression orthogonal design.A quadratic regression orthogonal model was established to express the relationship between soluble dietary fiber yield（Y）and four factors including dosage of cellulase（X1），enzymolysis pH（X2），enzymolysis temperature（X3），and enzymolysis time（X4）.Results showed：The optimal extraction paraneters were：dosage of cellulase 1.1%，enzymolysis pH5.8，enzymolysis temperature 55℃，and enzymolysis time 1.5h.Under such conditions，the highest yield of soluble dietary fiber，which was 9.80%±0.12%.The expansive capacity and water holding capacity were 1.97mL/g and 276%，respectively.The soluble dietary fiber of porphyra haitanensis could significantly slow POV value rising trends of oils and fats，and had a certain amount of time and concentration dependent．Prompt with antioxidant activity of the soluble dietary fiber of porphyra haitanensis.

porphyra haitanensis；soluble dietary fiber；optimization；quadratic regression orthogonal design；oilantioxidation

TS254.1

：B

：1002-0306（2014）16-0206-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.16.038

2013-10-25 *通讯联系人

赖蓓蕾（1992-），女，大学本科，研究方向：食品生物工程。

浙江省科技项目（2013C32107）；浙江温州大学项目（13SK50A）。