一氧化氮合酶基因多态性与青年缺血性卒中的关系研究

史从宁，王雅杰，赵运转，康熙雄

在世界范围内,缺血性卒中是主要的致死性疾病，其在青年人(15～45岁)中的发病率为3%～5%[1-2]。近年来有一些针对青年缺血性卒中发生机制的研究，凝血因子Ⅴ的Leiden突变、亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)C677T的多态性均被认为可能与青年缺血性卒中的发生相关[3-4]。内皮细胞一氧化氮合酶能生成一氧化氮，一氧化氮在血管动态调节方面起重要作用。一氧化氮是强血管扩张剂并能抑制血小板的聚集[5-6]。有试验表明，一氧化氮依赖的血管扩张活性受损在缺血性卒中的发生中起重要作用[7-8]。尽管做过一些研究，一氧化氮合酶的基因多态性和缺血性卒中的相关性仍不确定，尤其早发性缺血性卒中研究更少，一氧化氮合酶基因多态性和青年缺血性卒中的关系值得研究。本研究检测一氧化氮合酶内含子4(eNOS4)、MTHFR C677T、凝血因子Ⅴ G1691A的多态性，探讨其与青年缺血性卒中的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2011年4月—2012年7月首都医科大学附属北京天坛医院收治的青年缺血性卒中患者97例为研究组，其中男79例，女18例；年龄20～45岁。患者突然发病，迅速出现局限性神经功能缺失症状并持续24 h以上，神经症状和体征可以用某一血管综合征解释，颅脑CT或MRI发现梗死灶，梗死灶位于某一脑血管支配区域，排除脑出血、炎症性疾病等，即可确诊缺血性卒中。另同时期遵循年龄、性别频数匹配的原则，选择来自骨外科、普外科、消化内科、呼吸内科等其他科室的非缺血性卒中住院患者99例为对照组，排除心脑血管疾病，其中男80例，女19例；年龄21～45岁。入组患者均经过全面系统的检查，有详细的病史和个人史资料。

1.2 临床资料收集 收集患者性别、年龄、高血压、糖尿病、吸烟、饮酒情况，检测胆固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)水平、eNOS4、MTHFR C677T、凝血因子Ⅴ G1691A基因的多态性。

1.3 主要试剂和方法 基因组DNA提取试剂盒购自OMEGA公司；Taq酶、dNTP、20 bp DNA marker、50 bp DNA marker、DL 2000 DNA marker内切酶Hinf I均购自宝生物工程(大连)有限公司；内切酶Mnl I购自NEB公司，引物由上海英骏公司合成；无水乙醇、冰乙酸、乙二胺四乙酸(EDTA)购自北京化学试剂公司；琼脂糖购自genetech公司；Tris碱购自索莱宝公司。

基因组DNA提取严格按照说明书操作。eNOS4多态性测定由PCR完成，选用引物5′-AGCCCAGTAGTGAAGACCTGGTTAT-3′和5′-ACTCTTTGGCGGCCAGTGAT-3′，反应条件为 94 ℃ 5 min变性，35个循环94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min，4 ℃ 10 min，得到491 bp(4a)和518 bp(4b)的产物。

MTHFR C677T多态性检测首先进行PCR反应，选取引物5′-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3′和5′-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3′，反应条件为 94 ℃ 5 min变性，35个循环94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min，4 ℃ 10 min，用Hinf I限制性内切酶进行酶切后用4%的琼脂糖凝胶进行电泳，得到198 bp的为C等位基因，得到175 bp和23 bp的为T等位基因。

凝血因子Ⅴ G1691A多态性检测首先进行PCR反应，选取引物5′-TTTCAGGCAGGAACAACA-3′和5′-CTTCGGCAGTGATGGTAC-3′,反应条件为 94 ℃ 5 min变性，35个循环94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min，4 ℃ 10 min，得到424 bp的PCR产物，用Mnl I限制性内切酶进行酶切后用4%的琼脂糖凝胶进行电泳，G1691G型得到3个片段(167、220、37 bp),G1691A型得到2个片段(167、257 bp)。

2 结果

2.1 对照组和研究组临床资料比较 对照组与研究组性别、年龄及HDL水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；两组高血压检出率、糖尿病检出率、吸烟率、饮酒率及胆固醇、三酰甘油、LDL水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05，见表1)。

表1 对照组和研究组临床资料比较

注：HDL=高密度脂蛋白，LDL=低密度脂蛋白；*为t值

2.2 对照组和研究组基因型分布比较 对照组与研究组eNOS4基因型分布比较，差异有统计学意义(P<0.05)；两组MTHFR C677T基因型分布比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表2)；两组凝血因子Ⅴ基因型均为1691GG。

表2 对照组和研究组基因型分布比较(例)

Table2 Comparison of distribution of genotypes between control group and study group

组别例数eNOS4bb abMTHFRC677TTT CT CC对照组998118344520研究组97907294523χ2值52940586P值00210746

注：eNOS4=一氧化氮合酶内含子4，MTHFR=亚甲基四氢叶酸还原酶

2.3 青年缺血性卒中发生的影响因素 以是否发生缺血性卒中为因变量,以高血压、糖尿病、吸烟、饮酒(是=1，否=0)、血清胆固醇、三酰甘油、LDL水平(实测值)、eNOS4基因型(eNOS4 bb=1，eNOS4 ab=0)为自变量。多因素Logistic回归分析结果显示，高血压、糖尿病、吸烟、LDL水平、eNOS4基因型与青年缺血性卒中发生有回归关系(P<0.05,见表3)。

表3 青年缺血性卒中发生影响因素的多因素Logistic回归分析

Table3 Multivariate Logistic regression analysis on influencing factors for the occurrence of ischemic stroke in young people

变量βSEWaldχ2值P值OR值95%CI高血压187704192007600016532(2874，14846)糖尿病12920611447000343640(1099，12056)吸烟11340400804400053108(1420，6804)饮酒01370389012407251147(0535，2457)胆固醇-08360507272309900433(0160，1170)三酰甘油02340256084003591264(0766，2086)LDL14090606540000204094(1247，13438)eNOS4基因型15650603673200094782(1466，15593)

3 讨论

缺血性卒中是一种高发病率、高致残率、高致死率且高复发率的疾病，是当今严重威胁人类健康的三大疾病之一，2008年我国第三次死亡原因回顾性抽样调查结果显示，脑血管疾病已经超过恶性肿瘤和心血管疾病，成为我国居民第1位死亡原因[9]。近年来国内外研究均表明,缺血性卒中有年轻化的趋势,尤其是青年(18～45岁) 缺血性卒中发生有逐年增加的态势。流行病学相关调查表明，青年卒中占全部人群卒中的9.77%,以缺血性卒中为主,男性患者居多[10]。有研究显示，青年缺血性卒中最主要的原因是早发性动脉硬化(20%～30%)，高血压以及不良的生活习惯和嗜好(吸烟、饮酒)是动脉粥样硬化主要危险因素[11-12]。有研究在尸检中也证实在15～19岁意外死亡者中主动脉已经出现粥样硬化的早期病理改变[13]。随着年龄增长其他高危因素如高血脂、糖尿病等发病率上升也可导致动脉粥样硬化的发生。本研究发现,青年缺血性卒中患者中高血压检出率较对照组高，与李裕茂[14]报道的高血压是形成青年脑梗死的独立危险因素相一致，同时本研究也发现，糖尿病患病率、吸烟率、饮酒率、脂代谢指标的水平在研究组和对照组间均存在差异。

在缺血性卒中的发病过程中，遗传因素也起了很大的作用，对缺血性卒中基因的研究大多采用候选基因法，与青年缺血性卒中有关的候选基因包括血小板相关基因、凝血/纤溶基因、脂代谢基因、同型半胱氨酸代谢基因和其他基因。高凝状态被认为是青年缺血性卒中的最重要危险因素，在所有能导致高凝状态的危险因素中，凝血因子Ⅴ的Leiden突变是青年缺血性卒中最危险的基因多态性[15-16]。凝血因子V基因1691位点G被A所取代，使活化蛋白C裂解活化凝血因子V的位点消失，导致活化凝血因子V对活化蛋白C产生抵抗，从而导致血栓前状态。MTHFR的C677T多态性能导致血清同型半胱氨酸水平升高，也被认为是青年缺血性卒中的危险因素[17]。半胱氨酸在体内通过再甲基化和转硫化2种途径代谢，代谢的关键酶分别是MTHFR和胱硫醚β-合成酶(CBS)，酶活性的下降是导致高同型半胱氨酸血症的常见危险因素。MTHFR基因定位于染色体1p36.3，其C667T纯合突变使酶活性下降。研究认为，MTHFR的基因突变与青年人缺血性卒中有关，但目前仍存在争论[18]。内皮源性一氧化氮合酶(eNOS)水解L-精氨酸产生内皮源性一氧化氮(eNO)[19]。研究发现eNO在多种生理过程中以自分泌和旁分泌的方式发挥着重要作用，包括维持脑的基础血流量、维持脑血管的舒张和自动调节[20]，保持血管的完整性，抑制平滑肌增殖[21]。一氧化氮合酶的基因多态性可导致内皮功能紊乱，也和缺血性卒中相关，但和青年缺血性卒中的关系还不明确。

在本研究中选取青年缺血性卒中患者，年轻人受外界危险因素作用的时间短，发生疾病时基因起的作用要重要，方便找到该疾病的易患基因，其次是由于青年缺血性卒中的发病率有逐年上升的趋势，这带来了沉重的社会和经济负担。结果显示凝血因子Ⅴ1691GG未检测到突变型。这一结果说明凝血因子Ⅴ的Leiden突变不能作为中国青年缺血性卒中的危险因素。与其他研究结果不一致，其原因可能是由于种族特异性[3]。MTHFR 677TT基因型和血清同型半胱氨酸水平升高相关，升高的血清同型半胱氨酸水平可损坏内皮基质导致内皮功能紊乱[22]。但在本研究中，MTHFR 677TT基因型在研究组和对照组间无差异，不支持MTHFR 677TT基因型作为中国青年缺血性卒中的危险因素。eNOS4基因型在研究组和对照组间的分布有差异，对照组eNOS4 ab基因型的携带者比研究组多,与Hassan等[23]的研究结果相符。在Hassan等[23]的研究中还发现eNOS4 ab基因型和更高的一氧化氮水平相关。这种内含子的插入缺失多态性和疾病相关可能是由于其影响了mRNA的稳定性和酶水平。

总之，本研究结果eNOS4 bb基因型作为中国青年缺血性卒中的重要基因危险因子和以往的研究结果认为凝血因子Ⅴ的Leiden突变或其他易栓基因多态性是青年缺血性卒中的重要基因危险因子是不同的。提示内皮功能紊乱也许在青年缺血性卒中中发挥重要作用，尤其在中国人群中。但由于本研究样本量较小，需进一步扩大样本行长期研究。

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