印度梨形孢诱导烟草的抗病性分析

惠非琼，马杰，刘剑，聂长春，高其康，楼兵干*

1.浙江大学生物技术研究所，杭州市西湖区余杭塘路866号310058

2.贵州中烟工业有限责任公司，贵阳市云岩区友谊路25号 550001

3.浙江大学农生环测试中心，杭州市西湖区余杭塘路866号 310058

印度梨形孢诱导烟草的抗病性分析

惠非琼1，2，马杰1，刘剑2，聂长春2，高其康3，楼兵干*1

1.浙江大学生物技术研究所，杭州市西湖区余杭塘路866号310058

2.贵州中烟工业有限责任公司，贵阳市云岩区友谊路25号 550001

3.浙江大学农生环测试中心，杭州市西湖区余杭塘路866号 310058

内生真菌印度梨形孢（Piriformospora indica）能够增强植物体抗生物和非生物胁迫能力。为了明确印度梨形孢对诱导烟草抗病性的作用，分别进行了接种病原菌长柄链格孢、胶孢炭疽菌、终极腐霉和茄丝核菌后印度梨形孢定殖的烟草对赤星病、炭疽病、猝倒病和立枯病害的抗性试验，同时分析了接种长柄链格孢后烟叶中丙二醛（MDA）和脯氨酸（Pro）含量、抗氧化酶活性以及病程相关蛋白基因表达水平。结果表明：印度梨形孢定殖的烟草，接种长柄链格孢后，烟叶病斑显著减小，烟叶中MDA含量显著降低，Pro含量显著升高，病程相关蛋白基因PR-1a，PR2，PR3和PR5的表达量明显提高；接种胶孢炭疽菌后，烟叶病斑减小；终极腐霉和茄丝核菌对烟草的危害症状显著减轻。印度梨形孢能诱导烟草产生抗病性，是通过维持生物膜系统的完整性、稳定细胞内渗透压以及膜脂过氧化在较低水平、并调控病程相关蛋白基因的表达来实现的。

内生真菌；印度梨形孢；丙二醛；脯氨酸；烟草病害；病程相关蛋白基因

烟草在生长发育过程中会受到各种生物和非生物的胁迫，其中烟草病害是烟草生产中最常见的生物胁迫之一。烟草赤星病、炭疽病、猝倒病和立枯病等是我国烟叶生产上的主要病害，对烟叶产量和品质造成了严重影响［1-2］。目前，主要采用化学防治的方法来防治烟草病害，但所带来的抗药性、农药残留、环境污染等问题不容忽视。因此，需要寻求一种既安全又有效的防治烟草病害的方法。Verma等［3］从印度沙漠的灌木根上分离出印度梨形孢（Piriformospora indica），其作用与丛枝菌根真菌（Arbuscular Mycorrhiza Fungi，AMF）相似，能定殖于多种植物的根部，促进植物生长，提高寄主植物对生物和非生物逆境的耐受性；且能定殖于拟南芥等非菌根植物的根部，能在多种合成培养基上生长［4-10］。在生物胁迫方面，印度梨形孢不仅可以增强植物对根部病害的抗性，还能诱导植物产生系统诱导抗性［11-12］；印度梨形孢定殖的拟南芥和大麦对白粉病（Powdery Mildew）的抗性显著增强［5，13-14］；印度梨形孢定殖的小白菜中抗病蛋白基因的表达量显著提高，对黑斑病病菌［Alternaria brassica（Berk）Sacc.］的抗性增强［15］；印度梨形孢定殖的玉米组织中抗坏血酸和谷胱甘肽含量增加，对轮枝镰孢菌（Fusarium verticillioides）的抗性增强［16］。但有关印度梨形孢对烟草抗病性影响的报道却较少。为此，对印度梨形孢抗烟草赤星病（Alternaria longipes）、炭疽病（Colletotrichum gloeosporioides）、猝倒病（Pythium ultimum）和立枯病（Rhizoctonia solani）的作用及其机理进行了初步试验，旨在明确印度梨形孢在烟草抗病性方面的效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株与烟草品种

印度梨形孢（Piriformospora indica）由德国耶拿大学Ralf Oelmüller教授惠赠；病原菌：长柄链格孢（Alternaria longipes），菌种编号：CGMCC3.2946，购自中国微生物菌种保藏管理中心；胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）的GenBank号为JQ277720，终极腐霉（Pythium ultimum）菌株号为Cuc08，茄丝核菌（Rhizoctonia solani）菌株号为Tom03，均保存于浙江大学生物技术研究所；供试烟草品种为中烟100，由中国烟草总公司郑州烟草研究院提供。

1.1.2 菌株的培养

采用陈佑源等［10］的方法进行印度梨形孢的培养。

病原菌的培养：将长柄链格孢、胶孢炭疽菌、终极腐霉和茄丝核菌转接到PDA培养基上，置于温度为25℃的黑暗恒温培养箱中分别培养5，5，2和4 d后，用打孔器（直径为5 mm）沿菌落边缘打孔，供接种用。

1.1.3 植物材料的准备

烟草种子消毒后放在MS培养基平板上萌发，两周后，挑选长势一致的烟苗与印度梨形孢在MS培养基上共培养，同时设置空白对照，将各平板置于25/22℃（白天/黑夜），16/8 h（光暗交替），光照强度为5500 Lx的培养箱中培养。3～4周后，用台盼蓝染色并观察印度梨形孢在烟草根部的定殖情况，确保印度梨形孢成功定殖于烟草根部。4周后挑选长势一致的烟苗转移到基质（营养土∶蛭石∶珍珠岩=4∶2∶1）中，置于温室内，在温度25/22℃（白天/黑夜）、14/10 h（光暗交替）、相对湿度60%的条件下盆栽培养，按生产技术规范进行栽培管理。

1.2 方法

1.2.1 印度梨形孢在烟草根部的定殖

采用Sun等［9］的方法检测MS平板上与印度梨形孢共培养3～4周后烟草根部印度梨形孢的定殖情况。

1.2.2 烟草病原菌的接种

长柄链格孢和胶孢炭疽菌的接种：选取盆栽10周的烟苗，设置2个处理和2个对照。对照1（-Pi+A），将长柄链格孢和胶孢炭疽菌菌丝块分别接种于根部无印度梨形孢定殖的烟苗最大叶片上；处理1（+Pi+A），将长柄链格孢和胶孢炭疽菌菌丝块分别置于根部有印度梨形孢定殖的烟草最大叶片上；对照2（-Pi-A），将直径为5 mm的PDA培养基置于根部无印度梨形孢定殖的烟草最大叶片上；处理2（+Pi-A），将直径为5 mm的PDA培养基置于根部有印度梨形孢定殖的烟草最大叶片上。采用伤口接种法，在每片叶中部位置，以叶脉为对称轴，用灭菌石英砂轻轻摩擦产生微伤口，用无菌水冲去石英砂后，把菌丝块置于烟叶微伤口处，对接种后的烟株进行保湿培养48 h，每处理接种5株烟。温室中培养，定时观察、记录各处理烟草的生长情况。并于长柄链格孢病原菌接种后的0，6，12，24，48和72 h取样，迅速放入液氮中冷冻后，保存在-80℃超低温冰箱中备用。

终极腐霉和茄丝核菌的接种：选取MS培养基上培养4周的烟苗，将终极腐霉、茄丝核菌菌丝块分别置于有印度梨形孢定殖（处理1，+Pi+A）和无印度梨形孢定殖（对照1，-Pi+A）的烟苗根基部，每株烟苗根基部放置一块菌丝块；同时用直径为5 mm的PDA培养基置于根部有印度梨形孢定殖（处理2，+Pi-A）和无印度梨形孢定殖（对照2，-Pi-A）的烟苗根基部；用封口膜将培养皿密封后，置于温度25/22℃（白天/黑夜）、16/8 h（光暗交替）、光照强度为5500 Lx的培养箱中培养，每处理接种6株烟苗，定时观察并记录。

1.2.3 生理生化指标测定

参照陈建勋等［17］的方法测定样品中丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）含量和超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）的活性。重复3次，取平均值。

1.2.4 抗病相关基因表达量分析

参照惠非琼等［18］的方法提取各烟草叶片样品总RNA、合成cDNA第一条链并进行荧光定量PCR扩增。以Actin为内参，根据已报道的烟草病程蛋白相关基因设计特异性引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表1。

表1 烟草病程蛋白相关基因荧光定量PCR特异性引物

2 结果与分析

2.1 印度梨形孢在烟草根部的定殖状况

烟草与印度梨形孢共培养4周后，采用台盼蓝对烟草根系进行染色后在显微镜下观察，在与印度梨形孢共培养的烟草根系中，梨形厚垣孢子清晰可见并主要集中在根成熟区的表皮和皮层细胞中（图1）。

2.2 印度梨形孢对烟草赤星病抗性的影响

从图2可以看出，接种长柄链格孢菌后第6天，有印度梨形孢定殖的烟叶病斑直径明显小于对照；此时可以观察到对照烟叶病斑已扩大，病斑周围具有明显的淡黄色晕环；而在处理烟叶上，病斑较小（图2Ⅰ，图2Ⅱ）。对照烟叶赤星病斑直径是处理烟叶的1.7倍（图2Ⅲ），处理烟叶病斑面积比对照的病斑面积下降了64%。观测发现，空白PDA培养基接种的烟苗未出现异常。

2.3 印度梨形孢对烟草炭疽病抗性的影响

由图3可知，在接种胶孢炭疽菌后第4天，观察到对照烟叶上出现了明显病斑，而处理烟叶上病斑不明显（图3Ⅰ，图3Ⅱ）；接种病原菌后的第9天，对照烟叶上的病斑面积扩大，颜色变深，呈黄褐色，而处理烟叶病斑刚出现（图3Ⅲ，图3Ⅳ）。接种病原菌后4和9 d，对照烟草的病斑直径显著大于处理烟草（图3Ⅴ）。

图1 印度梨形孢在烟草根部的定殖情况

图2 接种长柄链格孢菌6 d后烟叶表型上的差异及病斑大小

2.4 印度梨形孢诱导烟草对猝倒病的抗性

接病原菌后第1天，烟苗根系和叶片未出现明显的病害症状（图4Ⅰ，图4Ⅲ）；第7天后，无印度梨形孢定殖的对照烟苗停止生长，根系呈褐色并腐烂，叶片枯萎变黄（图4Ⅳ）；而根部有印度梨形孢定殖的烟草仅表现出生长减缓，老叶变黄症状（图4Ⅱ）。第10天后，处理烟苗表现出叶片黄化症状，而对照烟苗几乎全部死亡。

图3 接种胶孢炭疽菌后烟草表型上的差异及病斑大小

图4 接种终极腐霉菌后的烟草病害症状

图5 接种茄丝核菌的烟草病害症状

2.5 印度梨形孢对烟草立枯病抗性的影响

接种病菌7 d后，观察发现根部无印度梨形孢定殖和有印度梨形孢定殖的烟苗生长均停止；第20天后，对照烟苗根系开始腐烂，颜色加深呈褐色（箭头所示），叶片变黄，而处理烟苗根系肉眼未见病变症状，只是叶片出现黄化（图5）。

2.6 接种长柄链格孢菌对烟叶中MDA和Pro含量的影响

未接种病原菌时，印度梨形孢定殖的烟草和对照烟草叶片中MDA含量无显著差异（图6Ⅰ）；接种病菌24 h后，对照烟草叶片中MDA含量上升，是处理烟草的1.2倍；随着接种后时间的延长，处理和对照烟草叶片中MDA含量均上升，对照烟草叶片中上升的速率快于处理；接种病菌48 h后，对照烟草叶片中MDA含量是处理烟草的1.7倍；接种病菌72 h后，处理和对照烟草叶片中MDA含量均有所下降，但对照叶片中含量是处理的1.4倍。说明病原菌侵染时，处理烟草叶片MDA含量显著低于对照。表明接种病原菌后，印度梨形孢的定殖能增强烟草抗氧化胁迫能力，减轻膜脂过氧化程度，提高烟草抵御逆境胁迫的能力。

图6 接种长柄链格孢菌后烟草叶片中MDA和Pro含量

接种病原菌前，有印度梨形孢定殖的处理烟草和对照烟草叶片中Pro含量无显著差异（图6Ⅱ）；接种病原菌后第24 h，处理烟草叶片中Pro含量上升；接种后第48和72 h，处理烟草叶片中Pro含量分别是对照的1.5和1.3倍，显著高于对照烟草。表明病原菌侵染时，印度梨形孢通过促进烟草中Pro的积累，进而提高烟草对病菌的抵御能力。

2.7 接种长柄链格孢菌对烟叶中CAT，POD和SOD活性的影响

接种病原菌前，有印度梨形孢定殖的处理烟草和对照烟草叶片中CAT，POD和SOD的活性基本一致；接种病原菌后，烟草叶片中SOD，POD和CAT活性呈先增加后降低的趋势；接种病原菌24 h，处理烟草叶片中CAT，POD和SOD活性均显著高于对照，分别是对照的1.2，1.6和1.2倍；接种病原菌48 h，烟叶中CAT，POD和SOD酶活性达到最大值，处理烟叶中酶活性显著高于对照，分别是对照的1.6，1.9和1.3倍；接种72 h，处理和对照烟叶中CAT，POD和SOD酶活性均下降，但处理烟叶中酶活性仍高于对照，分别比对照烟叶高24.7%，39.8%和13.4%（表2）。说明病原菌侵染时，印度梨形孢的定殖能提高烟叶中抗氧化酶活性。

表2 接种长柄链格孢菌后烟叶中CAT，POD和SOD活性①

2.8 接种长柄链格孢菌对烟叶中病程蛋白相关基因表达量的影响

从实时荧光定量PCR结果（图7）可以看出，未接种病原菌时，有印度梨形孢定殖的烟草和无印度梨形孢定殖的烟草叶片中病程蛋白基因PR-1a，PR2，PR3和PR5的表达量没有显著性差异；接种长柄链格孢菌后，处理和对照烟叶中基因PR-1a，PR2，PR3和PR5的表达量呈现出先升后降的变化趋势，对照烟草叶片中基因PR-1a，PR，PR3和PR5的表达上升幅度不大，而在处理烟叶中表达量显著上升。接种病原菌后第6 h，PR3和PR5表达量达到最大值，此时这2个基因在处理烟叶中的表达量分别是对照的4.2倍和2.7倍（图7Ⅲ，图7Ⅳ）；接种后第12 h，基因PR-1a和PR2的表达量达到最大值，此时处理烟草中基因表达量分别是对照的2.1倍和3.8倍（图7Ⅰ，图7Ⅱ）。说明病原菌侵染后，印度梨形孢能诱导烟草叶片中PR-1a，PR2，PR3和PR5基因超量表达。

图7 烟叶病程相关蛋白基因的相对表达水平

3 结论与讨论

印度梨形孢能在烟草根部定殖；病原菌侵染烟草时，印度梨形孢能显著减轻烟草受害的严重程度，诱导烟草对终极腐霉和茄丝核菌的抗性，显著增强植物对根部病害的抵抗力；同时还能诱导烟草对叶部病害赤星病和炭疽病的抗性，明显降低赤星病和炭疽病对烟草的危害。说明印度梨形孢可以诱导烟草产生系统性抗病性。

接种病原菌后，病程相关蛋白基因PR-1a，PR2，PR3和PR5在处理烟草中的表达量显著提高。这与Moliter等［19］的研究结果一致，表明印度梨形孢能够更早更快地诱导烟草中病程相关蛋白基因的表达。由此推断，印度梨形孢通过诱导病程相关蛋白快速、超量表达而对病原菌起到抑制作用，从而增强烟草的抗病性。

接种病原菌后，印度梨形孢的定殖提高了烟叶中SOD，POD和CAT活性，平衡植物中活性氧自由基，减轻活性氧自由基对植物细胞造成的伤害，表明印度梨形孢能有效激活烟草叶片中活性氧清除系统，减轻膜脂过氧化损伤，这与前人的研究结果一致［6，9］；印度梨形孢还能维持烟草叶片中MDA含量的相对稳定，促进烟草叶片中脯氨酸的积累。说明印度梨形孢是通过增强烟草细胞抗氧化能力，增加烟草内渗透调节物质的积累，进而提高烟草的抗病性。

总之，印度梨形孢能诱导烟草对土传和叶部病害的抗性，病原菌侵染时，印度梨形孢能调控烟草中抗逆物质的积累量和诱导病程相关蛋白的超量表达。印度梨形孢提高烟草抗病性是一个复杂的过程，在相关代谢物质调节和印度梨形孢对基因的调控方面还有待于进一步深入研究。

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Disease Resistance Analysis of Nicotiana tabacum Induced by Piriformospora indica

HUI Feiqiong1,2,MA Jie1,LIU Jian2,NIE Changchun2,GAO Qikang3,and LOU Binggan*1
1.Institute of Biotechnology,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China
2.China Tobacco Guizhou Industrial Co.,Ltd.,Guiyang 550001,China
3.Analysis Center of Agrobiology and Environmental Sciences,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China

Piriformospora indica(P.indica),a root-colonizing endophytic fungus,can improve the resistance of plants against biotic and abiotic stresses.In order to clarify the influences of P.indica on the disease resistance of Nicotiana tabacum,the resistance experiments against tobacco brown spot,anthracnose,damping off and sore shin were conducted wherein P.indica-colonized N.tabacum was inoculated with Alternaria longipes(A. longipes),Colletotrichum gloeosporioides(C.gloeosporioides),Pythium ultimum(P.ultimum)and Rhizoctonia solani (R.solani),respectively;and the contents of malondialdehyde(MDA)and proline,antioxidant enzyme activity and the expression levels of pathogenesis-related protein genes in tobacco leaves inoculated with A.longipes were analyzed.The results showed that comparing with the control,the size of disease spots and the MDA content in the leaves of P.indica-colonized N.tabacum inoculated with A.longipes reduced significantly,while the proline content and the expression levels of pathogenesis-related protein genes PR-1a,PR2,PR3 and PR5 increased significantly;the size of disease spots in the leaves of P.indica-colonized N.tabacum inoculated with C.gloeosporioides reduced;and damage symptoms of the leaves of P.indica-colonized N.tabacum inoculated with P.ultimum and R.solani significantly decreased.P.indica can improve the disease resistance of N. tabacum through maintaining the integrity of cell biomembrane system,keeping intracellular osmotic pressureand the peroxidation of membrane lipid at a lower level and regulating the expression of pathogenesis-related protein genes.

Endophyticfungus；Piriformosporaindica；Malondialdehyde；Proline；Tobaccodisease；Pathogenesis-related protein gene

TS414

A

1002-0861（2014）11-0074-06

贵州中烟工业有限责任公司科技项目“印度梨形孢对烟草的诱导抗病及降低烟叶重金属含量的作用”（201216）。

惠非琼（1988—），在读硕士研究生，研究方向：植物病理。E-mail：hfq543@126.com；*

楼兵干E-mail：bglou@zju.edu.cn

2014-05-30

责任编辑：董志坚E-mail：dzj@tobaccoinfo.com.cn电话：0371-67672650