河南烟草镰刀菌的初步分子鉴定

田艳艳，王伟杰，苗圃，李淑君，康业斌*

1.河南科技大学林学院，河南省洛阳市天津路70号 471000

2.洛阳市烟草公司嵩县支公司，河南省洛阳市嵩县金城路 471400

3.河南省烟草公司烟草研究所，河南省许昌市魏都区永昌大道 461000

河南烟草镰刀菌的初步分子鉴定

田艳艳1，王伟杰2，苗圃1，李淑君3，康业斌*1

1.河南科技大学林学院，河南省洛阳市天津路70号 471000

2.洛阳市烟草公司嵩县支公司，河南省洛阳市嵩县金城路 471400

3.河南省烟草公司烟草研究所，河南省许昌市魏都区永昌大道 461000

为了明确河南烟田危害烟草的镰刀菌种类，以烟叶主产区典型病株为样本，用组织分离法获得纯菌株，并对所得菌株进行形态学鉴定、rDNA-ITS序列分析及致病性测定。形态学观察结果表明，分离获得的22个菌株在PDA培养基上均产生茂密的菌丝，呈棉絮状，能产生黄、红、紫等色素，大型分生孢子镰刀形或椭圆形，无色、多胞；小型分生孢子卵形至椭圆形，无色、单胞或双胞。BLAST比对结果表明，在GenBank序列数据库中，菌株1～11号的DNA序列与登陆号为KC429789.1的Fusarium oxysporum（F.oxysporum）序列同源性达到95.77%以上；菌株12～18号与登陆号为JQ910159.1的Fusarium solani（F.solani）序列的同源性达到88.01%以上；菌株19～21号与登陆号HQ176444.1的Fusarium verticillioides（F.verticillioides）序列的同源性达到89.72%以上；菌株22号与登陆号为JX045841.1的Fusarium proliferatum（F.proliferatum）序列的同源性为90.74%。接种试验表明，4种镰刀菌均能侵染活体烟苗并产生典型症状。因此，河南烟田危害烟草的镰刀菌鉴定为F.oxysporum，F.solani，F.verticillioides及F. proliferatum。其中，F.proliferatum侵染烟草在河南为首次报道。

烟草；镰刀菌；形态鉴定；分子鉴定；致病性

镰刀菌（Fusarium spp.）侵染烟草会引起枯萎病与根腐病。目前在我国云南［1］、湖南［2］、贵州［1，3］、福建［4］、湖北［5］、安徽［6］、山东［7］等省均有发生。桑维钧等［3］首次报道了贵州省烟草镰刀菌根腐病的主要病原为茄病镰刀菌，但试验未对病原菌进行分子鉴定；陈志敏［4］发现福建烟草镰刀菌根腐病病原为尖孢镰刀菌［F.oxysporum（Schlecht）Wr．var．nicotianae Johnson］、茄病镰刀菌［F.solani（Mart.）Sacc.］、半裸镰刀菌［F.semitectum Berk］，其中尖孢镰刀菌致病性最强，是引起田间根腐病的优势病原种群；陈高航［5］证实了引起湖北恩施州烟草根腐病的致病菌是尖孢镰刀菌；赵杰［7］提出山东省烟草镰刀菌根腐病病原菌为茄病镰刀菌、尖孢镰刀菌和厚垣镰刀菌（F.chlamydosporium Wollenw.et Reinking），其中茄病镰刀菌为优势病原菌。2011—2012年调查发现河南烟田枯萎病与根腐病病株率一般为5%～10%，严重的达30%以上，而有关河南烟田侵染烟草的镰刀菌种类及优势病原菌的分子鉴定未见详细报道。为此，以河南省主要产烟县（市）烟草根、茎部具典型症状的烟株为样本，通过组织分离、形态学观察结合rDNA-ITS序列分析对病原菌进行鉴定，旨在明确危害河南烟草的镰刀菌种类，为生产中有效防治该病害提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品来源

2011—2012年，选择河南省邓州市、襄城县、嵩县等15个主要产烟县（市），每个县（市）选择不同区域、不同品种、不同田块类型的烤烟烟田，在烟草团棵期、旺长期、采收期分别进行3次普查，普查总面积不少于当地种植面积的1%。每次调查田块数量不少于10块，每块面积不少于667 m2，每块田采用对角线5点取样法，选取5个点，每个点随机调查50株，每块田共调查250株，取3～5株具有典型症状的病株，截取茎基部与部分根系或发病部位，由河南科技大学植物免疫学实验室进行相关病原菌的分离与鉴定。

1.1.2 试剂和仪器

Taq DNA聚合酶、10×PCR缓冲液（10×PCR buffer）、dNTP混合物（dNTP Mixture）购于TaKaRa公司，通用引物ITS1和ITS4由上海生工生物工程技术服务有限公司提供，BIOMETRA PCR仪（德国Biometra公司），BST-20M型凝胶成像系统（英国Uvitec公司）。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离

“天晓，为什么？”镜心羽衣扶起倒在石头旁的壶天晓，惊恐不安地问道，“你明明可以躲开的……你是怕……所以……”

在样品病健交界处，切取组织或髓部碟片置于PDA培养基平板上，于25℃恒温培养箱中培养，2～4 d待菌落形成后，挑取边缘菌落纯化［7］。依据纯化后的菌落特征分类编号，保存备用。

1.2.2 形态学观察

挑取培养菌丝制作临时水玻片，在光学显微镜下观察并记录分生孢子的大小、形状，厚垣孢子的有无等，依据Booth分类系统对镰刀菌进行分类鉴定［8-10］。

1.2.3 分子生物学鉴定

刮取培养5～7 d的菌丝体50 mg，采用CTAB法［11-12］提取基因组DNA。利用通用引物ITS1和ITS4对所提取的DNA进行PCR扩增，反应在25 μL反应体系中进行。PCR反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸105 s，30个循环；最后72℃延伸10 min，扩增产物在4℃条件下保存。取5 μL扩增产物，与1 μL上样缓冲液混匀，加入1%琼脂糖凝胶孔中，DNA Marker为对照，在1×TAE电泳缓冲液中电泳，以凝胶成像系统检测PCR扩增产物大小，观察到合适的条带后，将所对应的原始扩增产物（未纯化）40 μL由生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将测序结果在GenBank上进行BLAST比对，并使用ClustalX（1.83）软件对此序列进行校准后，利用MAGA5软件［12-13］以距离法［14］构建系统发育树。

1.2.4 室内致病性测定

在4类菌株中选出具有代表性的菌株各1皿，用打孔器制取直径5 mm的菌饼；选用温室内培育的10叶期健康盆栽小黄金1025烟苗，在烟苗根茎部用接种针针刺伤口；把制好的菌饼贴于伤口处，用脱脂棉蘸取无菌水包裹在接种处，每个菌株接种4株，以空白PDA培养基作对照。将接种后的烟苗置于25℃左右，12/12 h光暗交替条件下保湿培养。

2 结果与分析

2.1 培养性状与形态特征

试验共获得镰刀菌菌株22个，这些菌株在PDA培养基上培养，菌落大多数为白色，且菌落上有黄、红、黑、紫等色素产生，菌丝茂密，呈棉絮状，菌落生长质地均匀。

菌株1～11号在显微镜下观察到两种类型的分生孢子，一种呈卵形至椭圆形，（6～13）μm×（2.5～5）μm；另一种大型分生孢子纺锤形至镰刀形，顶端钩状，基部有足细胞，（23～53）μm×（2.5～5.5）μm。符合尖孢镰刀菌（F. oxysporum）的形态特征［8-10］。

菌株12～18号在显微镜下观察小型分生孢子卵形，（7～11）μm×（2～4）μm，大型分生孢子弯筒形至近镰刀形，顶端钝圆，略呈喙状，3～5个分隔，（27.5～48）μm×（3～ 5）μm。符合茄类镰刀菌（F.solani）的形态特征［8-10］。

菌株19～21号在显微镜下观察小型分生孢子椭圆至卵形，串生，呈链状排列，大多数单胞，偶有1个隔膜，无色。符合轮枝镰刀菌（F.verticillioides）的形态特征［8-10］。

菌株22号在显微镜下观察小型分生孢子长卵形或梨形，无隔或有1个隔膜，（4～11）μm×（2～4.5）μm。大型分生孢子细长，近直型，顶孢较尖，足细胞较明显，3～ 7个隔膜，以3～5个隔膜居多，6～7隔膜的较少，（25～ 72.5）μm×（2.8～5.8）μm，符合已报道的层出镰刀菌（F. proliferatum）的形态特征［15］。

2.2 ITS序列分析

将这22个菌株的PCR产物进行序列测定后，整合共获得3种不同的序列，其有效长度分别为1～11号菌株476 bp，12～18号菌株499 bp，19～22号菌株490 bp。

在GenBank数据库中进行比对，用DNAMAN分析软件将22个DNA序列与16个GenBank已登录的镰刀菌序列进行同源性比对。结果表明，1～11号菌株序列与数据库中登录号为KC429789.1等的F.oxysporum序列同源性为95.77%以上，结合形态学特征将这11个菌株鉴定为尖孢镰刀菌（F.oxysporum）；12～18号菌株序列与数据库中登录号为JQ910159.1的F.solani序列同源性达到88.01%以上，结合形态学特征将这7个菌株鉴定为茄病镰刀菌（F.solani）；19～21菌株序列与登录号为HQ176444.1等的F.verticillioides序列同源性达到89.72%以上，结合形态学特征将这3个菌株鉴定为轮枝镰刀菌（F.verticillioides）；对22号菌株进行rDNA-ITS序列测定，获得有效序列长度为499 bp，在GenBank上进行BLAST比对,与登录号为JX045841.1等的F.proliferatum序列同源性达到90.74%以上，表明22号菌株为层出镰刀菌（F.proliferatum）。

系统发育树分析结果（图1）表明，1～11号菌株序列与F.oxysporum亲缘关系最近；12～18号菌株序列与F.solani的亲缘关系最近；19～22号菌株序列与F.verticillioides和F.proliferatum亲缘关系最近，但串珠镰刀菌是一个复合种［16］，而轮枝镰刀菌F.verticillioides（Sacc.）Nirenberg和层出镰刀菌F.proliferatum是其复合种下所包含的两个种，所以在系统发育树中处于同一分支上。

图1 鉴定菌株与GenBank上相关序列的系统发育树Fig.1Phylogenetic tree of identify strains and correlation sequences

依据形态特征，结合rDNA-ITS序列分析，将河南烟田危害烟草的镰刀菌鉴定为尖孢镰刀菌F.oxysporum（Schlecht）Wr.、茄病镰刀菌F.solani（Mart.）Sacc.、轮枝镰刀菌F.verticillioides（Sacc.）Nirenberg及层出镰刀菌F.proliferatum（Matsushima）Nirenberg。

2.3 致病性

接种病原菌4 d后，接种部位变褐色，病斑上下扩展；8 d后褐色部位加深，下部两片叶变黄；11 d后病基部呈软腐状，略缢缩，根系出现大小不等的黄褐色病斑。取病茎与病根进行组织分离，可重新获得病原菌，而对照植株无症状，证明这4种镰刀菌均能对烟苗致病，并表现出了根腐病的症状。

3 小结与讨论

依据形态特征，结合rDNA-ITS序列分析及致病性测定结果，将河南烟田危害烟草的镰刀菌鉴定为尖孢镰刀菌（F.oxysporum）、茄病镰刀菌（F.solani）、轮枝镰刀菌（F.verticillioides）及层出镰刀菌（F.proliferatum），其中F.proliferatum侵染烟草在河南为首次报道，而尖孢镰刀菌分离频率达50.0%，茄病镰刀菌分离频率为31.8%，为河南省引起烟草枯萎病与根腐病的主要致病菌。这与桑维钧等［3］报道的贵州省烟草镰刀菌根腐病的主要病原菌为茄病镰刀菌，陈高航［5］报道的引起湖北恩施州烟草根腐病的致病菌是尖孢镰刀菌的结果相符。

本试验在形态学研究的基础上，对经过分子测序的几种镰刀菌的核糖体基因内转录间隔区（rDNA-ITS）进行BLAST比对，1～11号菌株鉴定为尖孢镰刀菌，12～18号菌株鉴定为茄病镰刀菌，19～21号菌株鉴定为轮枝镰刀菌，22号菌株鉴定为层出镰刀菌。而系统发育树的结果表明，该方法对于区分尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌是切实可行的，而对于区分轮枝镰刀菌和层出镰刀菌则较困难。原因可能是过去将小型分生孢子串生、呈念珠状排列的一类镰刀菌归为串珠镰刀菌（F. moniliforme），而据报道至少有8个交配群曾在串珠镰刀菌种名下或是其变种，其中轮枝镰刀菌和层出镰刀菌分别是A交配群和D交配群下的两个种［17-20］，有着非常近的亲缘关系，所以rDNA-ITS序列无法将两者截然分开，有待使用ALFPF方法和EF-lalfa基因［15］等方法做进一步验证。

在供试的病样中分离出层出镰刀菌，经致病性测定能够侵染烟草，这一结果与李冰［6］的试验结果一致。该菌还能引起水稻穗腐病［21］、玉米鞘腐病［22］和穗腐病［15］、大豆根腐病［23］、地黄根腐病［24］等，但对烟草致病性的强、弱仍有待进一步试验。

在镰刀菌对烟草的致病性试验中，由于受季节的限制，选择了10叶期健康的盆栽小黄金1025烟苗，在烟草抗黑胫病鉴定试验中该品种为感烟草黑胫病菌〔Phytophthora parasitica var.nicotianae（Breda de Hean）Tuke〕的鉴别寄主。而有关镰刀菌对目前生产中主栽烟草品种大田成株期的致病性尚有待进一步研究。

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Preliminary Molecular Identification of Fusarium Infecting Tobacco in Henan

TIAN Yanyan1,WANG Weijie2,MIAO Pu1,LI Shujun3,and KANG Yebin*1
1.College of Forestry,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471000,Henan,China
2.Songxian Branch of Luoyang Tobacco Company,Songxian 471400,Henan,China
3.Tobacco Research Institute of Henan Provincial Tobacco Company,Xuchang 461000,Henan,China

In order to identify the variety of Fusarium causing tobacco diseases in field,the typical infected tobacco plants were sampled from main tobacco growing areas in Henan,pure strains were isolated by tissue separation and identified by morphological method,pathogenicity test,and rDNA-ITS sequences analysis.The results of morphological observation showed that on PDA medium,all of the 22 isolated strains produced dense, gossypine hyphae with yellow,red or purple pigments;macroconidium was oval or sickle in shape,colorless, and multi-cell;microconidium was ovoid to oval in shape,colorless,single-cell or double-cell.BLAST analysis indicated that in GenBank sequence database,the homology of rDNA-ITS sequence was>95.77%between strains No.1-No.11 and Fusarium oxysporum(F.oxysporum,GenBank Accession No.KC429789.1),which was >88.01%between strains No.12-No.18 and Fusarium solani(F.solani,GenBank Accession No.JQ910159.1), >89.72%between strains No.19-No.21 and Fusarium verticillioides(F.verticillioides,GenBank Accession No. HQ176444.1),and>90.74%between strain No.22 and Fusarium proliferatum(F.proliferatum,GenBankAccession No.JX045841.1).Inoculation tests showed that all the mentioned Fusarium could infect living tobacco seedlings and generate typical symptoms.Consequently,the Fusarium infecting tobacco in Henan was identified as F.oxysporum,F.solani,F.verticillioides and F.proliferatum.F.proliferatum infection in Henan tobacco has not been reported before.

Tobacco;Fusarium;Morphological identification;Molecular identification;Pathogenicity

S432.41

A

1002-0861（2014）11-0089-04

中国烟草总公司科技项目“全国烟草有害生物调查研究”（110200902065）；河南省烟草公司科技项目“河南省烟草有害生物调查研究”（2012M10）。

田艳艳（1987—），在读硕士研究生，研究方向：植物免疫学。E-mail：15138751943@163.com；*

康业斌E-mail：kangyb999@163.com

2014-05-30

责任编辑：董志坚E-mail：dzj@tobaccoinfo.com.cn电话：0371-67672650