多金属富集植物李氏禾根系对铜吸收机理的研究

田静，张学洪，陈俊，刘杰

多金属富集植物李氏禾根系对铜吸收机理的研究

田静，张学洪*，陈俊，刘杰

桂林理工大学环境科学与工程学院，广西 桂林 541004

李氏禾（Leersia hexandra Swartz）是一种多金属富集植物，通过研究其根系吸收铜的途径和方式，有助于解释李氏禾对铜的富集现象，为开发李氏禾修复铜污染土壤的植物修复技术提供科学依据。本文在温室水培条件下，利用钙离子通道抑制剂（LaCl3）和钾离子通道抑制剂（TEA），研究了李氏禾根系铜吸收与钙、钾离子通道的关系；同时，在研究ATP酶抑制剂、解偶联剂和低温作用对铜吸收影响的基础上，探讨了李氏禾根系铜吸收与能量代谢的关系。结果表明，在1 mmol·L-1钙离子通道抑制剂的作用下，李氏禾根对铜的吸收明显被抑制了(p＜0.05)。处理48 h后，李氏禾根中铜的浓度较对照下降了39.2%。这说明李氏禾根吸收铜与钙离子通道密切相关。在5 mmol·L-1钾离子通道抑制剂的作用下，李氏禾根对铜的吸收与对照没用显著差异。这表明，李氏禾根系对铜的吸收可能不是通过钾离子通道进行的。ATP酶抑制剂钒酸钠(Na3VO4)显著地抑制李氏禾根对铜的吸收(p＜0.05)。25 μmol·L-1和50 μmol·L-1Na3VO4处理48 h后，李氏禾根中铜的浓度较对照分别下降了26.2%和31.0%。由此，推测李氏禾根系对铜的吸收是一个消耗能量的过程。该结果与解偶联剂抑制实验结果相一致。在25 μmol·L-1和50 μmol·L-1解偶联剂2,4-二硝基苯酚(DNP)作用下，李氏禾根系中的铜浓度较对照分别下降了25.8%和42.7%。低温处理对李氏禾根吸收铜的抑制作用较解偶联剂和ATP酶抑制剂更为明显。2 ℃下暴露48 h，李氏禾根中铜的浓度较对照(25 ℃)下降了60.1%。这进一步证明了，李氏禾根系对铜的吸收存在消耗能量的主动过程。

李氏禾；铜；吸收；抑制剂；主动运输

铜是生物必须的营养元素（BURKHEAD等，2009），适量的铜对人和动植物是有益的，但过量的铜则会对人和动植物的生长发育造成危害（倪才英等，2003）。在对环境污染较严重的Pb、Hg、Cd、Cu、As、Ni等重金属中，Cu的排放量较大，每年约为939000 t（SINGH等，2003）。因此，铜污染是亟待解决的环境问题。

植物修复技术(phytoremediation)被认为是修复铜等重金属污染土壤和水体最经济有效的方法，以廉价、高效、具有审美价值和长期应用等优点，受到广泛的推崇（KUMER等，1995；ZHAO和MCGRATH，2009）。该技术的理论核心是通过超富集植物或富集植物对重金属的吸收和积累，从而去除土壤或水体中的重金属。因此，超富集/富集植物作为植物修复的基础和核心载体成为研究的热点。

李氏禾(Leersia hexandra Swartz)是国内首次报道的铬超富集植物（张学洪等，2006）。已有研究表明，李氏禾对铜也表现出较强的富集能力（张学洪等，2008）。目前，人们对富集植物吸收转运金属离子的机理认识比较有限，主要的研究成果都来源于Cd、As、Zn等几种重金属（WEBER等，2004；VERBRUGGEN等，2009；ZHAO等，2009），关于富集植物吸收铜的机理研究相对较少。因此，李氏禾根对Cu的吸收途径和方式会成为值得研究的科学问题，有助于解释李氏禾对铜的富集现象，同时也为开发李氏禾修复铬、铜复合污染环境的植物修复技术提供科学依据。

本文通过水培实验研究了离子通道抑制剂、ATP酶抑制剂、解偶联剂和低温对铬超富集植物李氏禾根系吸收铜的影响，从能量抑制和离子拮抗的角度探讨了李氏禾根系吸收铜的机理，为揭示富集/超富集植物吸收铜的生物学机制提供线索。

1 材料与方法

1.1植物培养

水培试验的李氏禾采自未受重金属污染的桂林市雁山镇田边。选取生长一致的李氏禾幼苗，用

去离子水洗净，放入含有1/2强度的改良Hoagland营养液的1.5 L塑料盆中，于人工气候箱（LRH-550-GSI）中培养，控制植物生长条件为：光照周期12 h，25 ℃白天/20 ℃晚上，相对湿度75%，光照强度7000 Lx。每天加1次超纯水来保持培养液的体积，每3 d更换1次营养液。培养10 d后用于以下各种试验处理。

1.2离子通道抑制剂对Cu吸收的影响

实验前，将李氏禾幼苗转移至pH为5.5的250 µmol·L-1CaCl2溶液中预培养。12 h后，对李氏禾幼苗进行如下3组处理：（1）0.3 mmol·L-1CuSO4（对照）；（2）1 mmol·L-1钙离子通道抑制剂（LaCl3）+0.3 mmol·L-1CuSO4；（3）5 mmol·L-1钾离子通道抑制剂（TEA）+0.3 mmol·L-1CuSO4。所有处理的pH值均调至5.5左右，分别于处理后的1、2、4、8、12、24和48 h收获植物，每个时间点设3个重复。

1.3代谢抑制剂对Cu吸收的影响

实验前，将李氏禾幼苗转移至pH为5.5的250 µmol·L-1CaCl2溶液中预培养。12 h后，对李氏禾幼苗进行如下5组处理：（1）0.3 mmol·L-1CuSO4（对照）；（2）25 μmol·L-1ATP酶抑制剂（Na3VO4）+0.3 mmol·L-1CuSO4；（3）50 μmol·L-1Na3VO4+0.3 mmol·L-1CuSO4；（4）25 μmol·L-1解偶联剂2,4-二硝基苯酚（DNP）+0.3 mmol·L-1CuSO4；（5）50 μmol·L-1DNP+0.3 mmol·L-1CuSO4。所有处理的pH值均调至5.5左右，分别于处理后的1、2、4、8、12、24和48 h收获植物，每个时间点设3个重复。

1.4低温对Cu吸收的影响

实验前，将李氏禾幼苗转移至pH为5.5的250 µmol·L-1CaCl2溶液中预培养。12 h后，加入含有0.3 mmol·L-1CuSO4的培养液，然后将处理后的植物立刻放进2 ℃的人工气候箱中培养，分别于处理后的1、2、4、8、12、24和48 h收获植物，每个时间点设3个重复，以1.2中的对照作为正常温度（25 ℃）的对照。

1.5样品分析方法

将植物的根放入含有10 mmol·L-1EDTA的超声波中清洗3次，每次清洗10 min，去除吸附在植物根表面的金属离子（LEITA等，1991）。清洗后的根用去离子水洗3次，再用吸水纸把表面的水吸干。将新鲜的样品放入105 ℃烘箱内杀青30 min，然后80 ℃烘干至恒重，再磨碎。

磨碎的样品用浓HNO3和H2O2进行消解，铜的含量用火焰原子吸收分光光度法测定。

1.6数据处理

本研究的实验数据采用三个平行样测定值的算数平均值±标准差（SD）表示，数据采用SPSS10.0软件中的单因素方差（ANOVA）进行统计分析，用最小显著差数法（LSD）对数据进行显著性检验（p＜0.05）。采用Origin 8进行作图。

图1 钾钙离子通道抑制剂对李氏禾根吸收Cu的影响Fig.1 Effects of TEA and LaCl3on Cu uptake by roots of L. hexandra

2 结果与分析

2.1离子通道抑制剂对李氏禾根吸收Cu的影响

在离子通道抑制剂的作用下，李氏禾根吸收Cu（0.3 mmol·L-1）的动态变化过程如图1所示。在1 mmol·L-1钙离子通道抑制剂（LaCl3）的作用下，李氏禾根对Cu的吸收明显被抑制（p＜0.05，图1）。处理48 h后，李氏禾根中Cu的浓度较对照下降了39.2%。表明李氏禾对Cu的吸收与钙离子通道密切相关。然而，在5 mmol·L-1钾离子通道抑制剂（TEA）的作用下，李氏禾根对Cu的吸收并没有明显被抑制，这说明李氏禾对Cu的吸收可能不通过钾离子通道进行。

2.2代谢抑制剂对李氏禾根吸收Cu的影响

在ATP酶抑制剂（Na3VO4）的作用下，李氏禾根吸收Cu的动态变化过程如图2所示。25 μmol·L-1和50 μmol·L-1Na3VO4均能显著抑制李氏禾根对Cu的吸收（p＜0.05）。25 μmol·L-1和50 μmol·L-1Na3VO4处理48 h后，李氏禾根中Cu的浓度较对照分别下降了26.2%和31.0%。在同一Cu浓度处理下，Na3VO4对李氏禾根吸收Cu的抑制作用并不随Na3VO4浓度的增加而增加。这说明在48 h内，25 μmol·L-1和50 μmol·L-1Na3VO4对李氏禾根吸收Cu的抑制作用没有显著差异（图2）。

在解偶联剂2,4-二硝基苯酚（DNP）的作用下，李氏禾根吸收Cu的动态变化过程如图3所示。25 μmol·L-1和50 μmol·L-1DNP均能显著抑制李氏禾根对Cu的吸收（p＜0.05）。25 μmol·L-1和50 μmol·L-1DNP处理48 h后，李氏禾根中Cu的浓度较对照分

别下降了25.8%和42.7%。与Na3VO4作用下不同的是，在同一Cu浓度处理下，DNP对李氏禾根吸收Cu的抑制作用会随着DNP浓度的增加而增加。在48 h内，50 μmol·L-1DNP对李氏禾根吸收Cu的抑制作用显著大于25 μmol·L-1DNP（p＜0.05）。但是在2h之前，DNP浓度对李氏禾根吸收Cu的抑制作用的影响并不明显。可能的原因是DNP对李氏禾根的代谢抑制具有时间延迟。

图2 Na3VO4对李氏禾根吸收Cu的影响Fig.2 Effects of Na3VO4on Cu uptake by roots of L. hexandra

图3 DNP对李氏禾根吸收Cu的影响Fig.3 Effects of DNP on Cu uptake by roots of L. hexandra

图4 低温对李氏禾根吸收Cu的影响Fig.4 Effects of low temperature on Cu uptake by roots of L. hexandra

2.3低温对李氏禾根吸收Cu的影响

在2 ℃时，李氏禾根吸收Cu的动态变化过程如图4所示。2 h后，2 ℃处理后的李氏禾根对培养液中Cu的吸收均受到显著地抑制。8 h时，2 ℃处理的李氏禾根中Cu的浓度较对照（25 ℃）下降了54.5%。在48 h时抑制作用最为明显，李氏禾根中Cu的浓度较对照（25 ℃）下降了60.1%。这表明李氏禾根对Cu的吸收与植物的代谢水平有关。当代谢水平下降时，李氏禾根对Cu的吸收明显下降。

3 讨论

离子通道是细胞膜上的蛋白质孔道，通过通道门的快速启闭来控制离子穿过等离子体膜的扩散，是选择性的离子过滤器（DUTERTRE和LEWIS，2010）。Ca2+和K+通道是两个重要的阳离子通道，分别可通过LaCl3和TEA进行抑制。LaCl3是一种非特异性的Ca2+通道抑制剂，能够抑制质膜上ATP酶的活性，并且阻碍细胞内外离子交换（BONDGAARD和BJERREGAARD，2005）。本实验中，LaCl3显著抑制了李氏禾根系对铜的吸收，而TEA对李氏禾根系吸收铜没有抑制作用，这表明李氏禾根系吸收铜与Ca2+通道密切相关，但是可能不通过K+通道。施积炎（施积炎等，2004）等发现海州香薷根对铜的吸收与钙离子通道密切相关，而鸭跖草根对铜的吸收则可能不通过钙离子通道。由此可见，重金属进入植物体内的离子通道的类型不仅与重金属的种类有关，而且还与植物的种类有密切关系。

P型-ATP酶起着维持细胞内外的离子平衡的作用，是通用的离子泵。微量的钒酸钠（Na3VO4，μmol级）即可抑制各种P型-ATP酶的活性（WILLIAMS等，2000）。Tabata（TABATA等，1997）等首次报道拟南芥中存在PAA1（一种P型-ATP酶），并参与转运Cu进入叶绿体。Shikanai（SHIKANAI等，2003）等通过给Cu/Zn过氧化物歧化酶和内囊体腔蛋白质体蓝素提供辅酶，证明HMA6（PAA1）负责转运铜跨膜进入叶绿体。Southron（SOUTHRON等，2004）等在欧洲油菜中发现了铜的转运体RAN1。Elizabeth（ELIZABETH和MARY，2006）等发现有三种P1B-ATP酶参与铜跨膜转运到叶绿体中。本实验中，在0.3 mmol·L-1Cu处理下，25 μmol·L-1和50 μmol·L-1Na3VO4均能显著抑制李氏禾根对铜的吸收（图2），这表明李氏禾内存在转运铜的P型-ATP酶，铜的吸收与P型-ATP酶的活性有密切关系，即李氏禾根对铜可能存在主动吸收的作用。

2,4-二硝基苯酚DNP是一种氧化磷酸化的化学解偶联剂，由于它可以通过破坏线粒体内膜两侧的质子梯度从而抑制ATP生成，而且解偶联剂还可以引起线粒体中ATP的大量水解（FELLE和BENTRUP，1977；TRIPATHI等，1995）。由于大部分的生命活动都需要耗能，因此线粒体内的产能过程对生命体极为重要（SCHRAUWEN等，2006）。Sergi（SERGI和DENNIS，2002）等认为Cu+是通过与两种高亲和力转运体Ctr1、Ctr2和一种低亲和力转运体Fet4结合才从外界跨膜进入细胞内的。本实验中，25 μmol·L-1和50 μmol·L-1DNP均能显著抑制李氏禾根对Cu的吸收（图3），这表明解偶联剂的使用减少了植物的能量供应，而转运蛋白通过构象变化来跨膜转运离子是一个需要能量的过程。进一步说明李氏禾根吸收铜需要消耗能量，可能是一个主动吸收的过程。这一实验结果与Na3VO4抑制吸收的结果一致。

为了排除代谢抑制剂本身对植物细胞通透性的破坏，从而对植物吸收铜造成影响，因此还分析了低温（2 ℃）对李氏禾根吸收铜的影响。实验结果表明，48 h后，低温对李氏禾根吸收铜的抑制作用最为显著。因为低温能够影响酶的活性从而抑制植物的总体代谢水平（RUELLAND和ZACHOWSKI，2010），因此同时抑制了Cu2+和Cu+的吸收。低温实验结果又进一步证实李氏禾根对铜的吸收可能存在主动吸收的机制。施积炎（施积炎等，2004）等研究也表明，海州香薷和鸭跖草对铜存在主动吸收。本研究结果显示，Na3VO4、DNP和低温均能显著抑制李氏禾根对铜的吸收，表明李氏禾根对铜的吸收是一个主动吸收的过程。植物对金属离子的主动吸收机制有助于将土壤或水体中更多的重金属离子转移到植物体内，有利于利用植物修复技术修复被重金属污染的环境。

4 结论

钙离子通道抑制剂（LaCl3）显著抑制了李氏禾根系对铜的吸收，而钾离子通道抑制剂（TEA）对李氏禾根系吸收铜没有抑制作用，这表明李氏禾根系吸收铜与钙离子通道密切相关，可能不通过钾离子通道进行。

ATP酶抑制剂钒酸钠（Na3VO4）、解偶联剂2,4-二硝基苯酚（DNP）和低温（2 ℃）处理均能显著地抑制李氏禾根系对铜的吸收，这表明李氏禾根系吸收铜存在主动吸收机制。

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Mechanisms of Cu Uptake in a Multi-metal Accumulating Plant Leersia hexandra Swartz

TIAN Jing, ZHANG Xuehong*, CHEN Jun, LIU Jie
College of Environmental Science and Engineering, Guilin University of Technology, Guilin 541004, China

Leersia hexandra Swartz is a multi-metal accumulating plant. The study on the mechanisms of Cu uptake by roots of L. hexandra will help to understand how plants accumulate copper. Additionally, understanding Cu uptake mechanisms in plants is also valuable for phytoremediation of Cu-contaminated soil by L. hexandra. In the present work, a series of greenhouse hydroponic experiments were carried out to study the relationship of Cu2+uptake with Ca2+and K+channels using a calcium ion channel blocker (LaCl3) and a potassium ion channel blocker (TEA). Effects of ATPase inhibitor, uncoupler, and low temperature on Cu2+uptake by roots of L. hexandra were also studied, respectively. Based on these experiments, Cu uptake mechanisms in L. hexandra were discussed. The results showed that Ca2+channel blocker significantly limited the Cu uptake (p＜0.05). After 48 h treatment with 1 mmol·L-1LaCl3, Cu concentration in the roots was decreased by 39.2% as compared to the control group, which indicated that Cu uptake by roots of L. hexandra was closely related to Ca2+channel. Conversely, K+channel blocker did not inhibit Cu uptake, suggesting that Cu2+did not pass through potassium ion channels. ATPase inhibitor (Na3VO4) significantly limited the Cu uptake (p＜0.05). Cu concentrations in the roots exposed to 25 μmol·L-1and 50 μmol·L-1Na3VO4for 48 h were decreased by 26.2% and 31.0%, respectively. Therefore, the Cu uptake by the roots of L. hexandra may need energy consumption. This was supported by the observation that Cu uptake was significantly limited by an uncoupler, 2, 4-dinitrophenol (DNP). Cu concentrations in roots were decreased by 25.8% and 42.7% compared to control after 48 h exposure to 25 μmol·L-1and 50 μmol·L-1DNP. Effects of low temperature on Cu uptake were more pronounced than those of ATPase inhibitor and uncoupler. Cu concentration in roots was decreased by 60.1% at 2 ℃ for 48 h. The result confirmed that the Cu uptake by roots of L. hexandra was an active process dependent on energy consumption.

L. hexandra; Cu; uptake; inhibitors; active transport

X173

A

1674-5906（2014）07-1217-05

国家自然科学基金项目(41361085)；“八桂学者”建设工程专项经费资助；广西危险废物处置产业化人才小高地基金

田静（1988年生），女，硕士研究生，主要研究方向为重金属污染及恢复生态学。E-mail: tianjing421@sina.com

*通讯作者：E-mail: zhangxuehong@x263.net

2014-03-03

田静，张学洪，陈俊，刘杰. 多金属富集植物李氏禾根系对铜吸收机理的研究[J]. 生态环境学报, 2014, 23(7): 1217-1221.

TIAN Jing, ZHANG Xuehong, CHEN Jun, LIU Jie. Mechanisms of Cu Uptake in a Multi-metal Accumulating Plant Leersia hexandra Swartz [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2014, 23(7): 1217-1221.