耐性细菌的分离鉴定及重金属污染修复初步研究

陈佳亮，刘晓文，张雅静，方晓航*

耐性细菌的分离鉴定及重金属污染修复初步研究

陈佳亮1,2，刘晓文2，张雅静2，方晓航2*

1. 广东省环境科学研究院，广东 广州 510045；2. 环境保护部华南环境科学研究所，广东 广州 510655

清远市是中国最大的电子废弃物拆解基地之一，小作坊生产模式已经进行了20多年，大量无法回收的电子废料和处理残渣等被倾倒在田地、沟渠和山谷中，致使周边土壤长期受到重金属Cd、Cu、Pb污染。近年来国内外对拆解区周边的土壤重金属污染现状分析、健康风险评价等相关报道较多，但针对电子废弃物复合重金属污染生物修复技术的研究却并不多见。通过富集、驯化、分离，从清远市电子废弃物拆解区污染土壤中得到4种耐性菌株，经菌落形态、扫描电镜分析以及16S rDNA技术鉴定得出，菌株HS-01、JH-02、YB-03、JY-04分别为海水芽孢八叠球菌（Sporosarcina aquimarina）、佐吕间湖生芽孢八叠球菌（Sporosarcina saromensis）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）。由生长特性实验得到，细菌HS-01与JY-04生长周期相同，在0～8 h为调整期，8～12 h为对数期，12～24 h为稳定期，24～32 h为衰亡期。而细菌JH-02与YB-03生长周期相同，在0～4 h为调整期，4～12 h为对数期，12～24 h为稳定期，24～32 h为衰亡期。细菌HS-01、JH-02、JY-04的最适温度与pH分别为30 ℃和8，而YB-03则为35 ℃与7.5。生物吸附实验结果显示，随着重金属离子质量浓度的升高，4种耐受细菌对重金属离子的吸附量也逐渐升高，但吸附量增长率以及吸附率却逐渐降低，这4种细菌对Cd2+、Cu2+、Pb2+最大吸附量分别达到了2.25、2.05、2.28、2.25 mg，8.19、4.95、8.53、11.78 mg和10.84、10.59、7.66、9.02 mg。最大吸附率则分别达到了94.4、99.2、100、93.3%，86.1、90.8、88.6、87.3%和88.9、82.2、81.2、86.7%。其中细菌HS-01、YB-03、JY-04吸附Cd2+能力较强，而细菌JY-04对Cu2+以及HS-01、JH-02对Pb2+吸附能力最强。上述结果显示了4种耐性细菌均具有较好的修复复合重金属污染水体的应用潜力，但对于电子废弃物复合重金属污染土壤的修复机理和效率还有待进一步研究。

电子废弃物；土壤；耐性细菌；重金属；复合污染修复

表1 土壤基本性质Table 1 Basic properties of soils

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 土壤样品

耐性细菌的筛选土壤采自广东省清远市电子废弃物拆解区周边表层土壤（0～20 cm），土壤基本性质与采样点信息见表1。采用电位测定法（国家林业局，1999）测定土壤pH值，HNO3+HClO4+HF消解，火焰原子吸收光谱法（鲍士旦，2000；王春铭等，2013）测定土壤Cd、Cu、Pb全量；仪器使用火焰原子吸收分光光度仪（PerkinElmer PinAAcle 900T）。

1.1.2 培养基

1）富集培养基（Tamer和Sibel，2006）：葡萄糖2 g，KH2PO43 g，(NH4)2SO4·7H2O 0.5 g，MgSO42 g，CaCl2·2H2O 0.25 g，FeSO4·7H2O 0.1 g，NaCl 0.1 g，蒸馏水1 L，调节pH至7.0。2）固体培养基（Seulki等，2012）：牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，琼脂18 g，NaCl 5 g，蒸馏水1 L，调节pH至7.0。3）生物吸附水溶液：富集培养基的基础上，加入CdCl2·21/2H2O、CuSO4·5H2O、Pb(NO3)2试剂，使溶液Cd2+、Cu2+、Pb2+复合质量浓度分别达到10、50、50 mg·L-1，20、100、100 mg·L-1与40、200、200 mg·L-13个梯度。

1.2方法

1.2.1 菌株的驯化分离

驯化分离方法参照（靳治国，2010）相关研究加以改进。将5 g土壤样品加入装有100 mL无菌水的150 mL锥形瓶，150 r·min-1震荡2 h后放置30 min，将富集培养基制备成Cd2+、Cu2+、Pb2+质量浓度分别为10、100、100 mg·L-1的复合溶液，向150 mL锥形瓶中加入该溶液100 mL，将5 mL土壤上清液加入锥形瓶，在30 ℃下以150 r·min-1振荡培养3 d，浊度增加后，取5 mL转入新的复合溶液中，连续3次，然后增加复合溶液Cd2+、Cu2+、Pb2+的质量浓度至100、1000、1000 mg·L-1，重复上述步骤，将所得菌液稀释104～108倍后均匀涂布到固体培养基上，待长出菌落后，挑取生长丰满的单菌落，划线获得纯培养。

1.2.2 菌株的鉴定

1）PCR扩增：细菌引物为大肠杆菌27F（5′-AGATTTGATCMTGGCTCAG-3′）与1492R (5′-TACGGYTACCTTGTTACGAC TT-3′)，在PCR仪（Takara TP600）中进行。2）电泳：对反应后的PCR产物进行电泳，PCR产物上样量为3 μL。3）DNA测序：对PCR产物进行测序，在NCBI数据库中进行Blast同源性比对，与GenBank数据库中的已知菌株的序列进行比较，相似度最高的即为该菌株的菌种名。

1.2.3 扫描电镜分析

微生物样品制备方法参考（梁静南等，2013）相关研究，用导电胶将样品固定于样品台上，置于自动涂料器（JCF-1600）中进行真空镀金处理后，用SEM扫描电镜（JEOL JSM-6510LV）在15KV加速电压下观察，保存不同放大倍数下的扫描电镜照片。

1.2.4 生长特性研究

生长曲线、温度影响、pH影响的测定方法在相关研究基础上加以改进（张璐，2009）。1）生长曲线：将筛选得到的菌株接种于富集培养基中活化24 h，取2 mL加入盛有100 mL富集培养基的150 mL锥形瓶中，30 ℃下摇床150 r·min-1震荡培养，选择600 nm的波长，每4 h用分光光度计（Spectrumlab 752sp）测定菌液的OD600值，以培养时间为横坐标，OD600值为纵坐标，绘制细菌生长曲线，以未接种的富集培养基作空白对照，每个处理设置3个重复。2）温度影响：将菌株活化24 h，取2 mL加入100 mL富集培养基中，温度设置为10、20、25、30、35、40、50 ℃，150 r·min-1震荡培养24 h，每个处理设置3个重复，分光光度计比色法测定菌液的OD600值。3）pH影响：将菌株活化24 h，取2 mL加入100 mL富集培养基中，用1 mol·L-1的HCl和NaOH准确调节培养基pH为4、6、6.5、7、7.5、8、10，于30 ℃摇床150 r·min-1震荡培养24 h，每个处理设置3个重复，分光光度计比色法测定菌液的OD600值。

1.2.5 生物吸附特性研究

取2 mL菌液加入100 mL富集培养基，在30 ℃下150 r·min-1震荡培养24 h，记录菌液OD600值，离心后将菌体加入100 mL含Cd2+、Cu2+、Pb2+质量浓度分别为10、50、50 mg·L-1，20、100、100 mg·L-1与40、200、200 mg·L-13个梯度的复合溶液。150 mL锥形瓶中30 ℃下150 r·min-1震荡培养2 h，离心过滤后测定清液中重金属质量浓度，以未接种的复合溶液作空白对照，每个处理设置3个重复。细菌对重金属离子吸附率除计算公式为：β=(ρ0−ρe )/ρ0×100%。式中：ρ0为溶液中重金属离子的初始质量浓度，mg·L-1；ρe为吸附反应后溶液中重金属离子质量浓度，mg·L-1。

2 结果与讨论

2.1菌株的分离

对采自清远市电子废弃物拆解区周边污染土样中的微生物进行富集、驯化、分离。依据菌落形态、大小和颜色等特征，最终从6个土壤样品中筛选出4种菌株，其中将土壤样品1-1中分离得到的2种菌株命名为HS-01、JH-02、将土壤样品2-1中分离得到的2种菌株命名为YB-03、JY-04。

2.2扫描电镜分析

分析平板菌落形态（李振高等，2008）并结合扫描电镜分析（图1）得到：HS-01菌落呈不规则状，表面隆起有光泽，边缘波状，黄色湿润不透明，菌体呈球形和卵圆形，直径约为0.4～1 μm，周长约为0.6～1.2 μm；JH-02菌落呈假根状，表面扁平无光泽，边缘裂片状，白色干燥不透明，菌体呈球杆状，直径约为0.4～0.6 μm，周长约为0.8～1.2 μm；YB-03菌落呈点状，表面隆起有光泽，边缘完整，淡黄色湿润半透明，菌体呈球杆状，直径约为0.4～0.8 μm，周长约为0.6～1 μm；JY-04菌落呈不规则状，表面乳突有光泽，边缘波状，白色湿润半透明，菌体呈杆状和球杆状，直径约为0.6～1.2 μm，周长约为1.2～1.8 μm。

2.3菌株的鉴定

经PCR扩增出的4种产物大小均为1500 bP(图 2)，Blast同源性比对结果显示，菌株HS-01与Sporosarcina aquimarina strain KUDC1821同源性达到100%；JH-02与Sporosarcina saromensis strain KUDC1822同源性最高，达到98%；YB-03与Bacillus megaterium strain JN34同源性最高，达到了99%；JY-04与Bacillus methylotrophicus strain PY5同源性达到100%。结合平板菌落呈形态和扫描电镜分析结果得出，4株菌株HS-01、JH-02、YB-03、JY-04分别为海水芽孢八叠球菌（Sporosarcina aquimarina）、佐吕间湖生芽孢八叠球菌（Sporosarcina saromensis）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）。

图1 细菌扫描电镜图Fig. 1 SEM images of bacteria

图2 PCR产物电泳图Fig. 2 PCR produets of electrophoresis

图3 细菌生长曲线Fig. 3 Growth curves of bacteria

2.4生长特性研究

4种耐性细菌生长曲线如图3所示，细菌HS-01与JY-04生长周期相同，在0～8 h为调整期，8～12 h为对数期，12～24 h为稳定期，24～32 h为衰亡期；而细菌JH-02与YB-03生长周期相同，在0～4 h为调整期，4～12 h为对数期，12～24 h为稳定期，24～32

h为衰亡期。细菌接种量与营养物质含量一定的情况下，调整期时间长短与细菌适应能力有关（周艾平，2011）。细菌JH-02与YB-03调整期时间较短，相比于HS-01与JY-04适应性更强。另外，细菌YB-03与JY-04菌液OD600最大值分别达到1.760、1.679，高于细菌HS-01与JH-02的0.801、0.671。

图4 温度与pH对细菌生长的影响Fig. 4 Effect of temperature and pH on growth of bacteria

温度与pH影响实验显示（图4），在温度过低（10 ℃）与过高（50 ℃）环境下，4种细菌的OD600值显著下降，其中细菌HS-01、JH-02在40 ℃时OD600值已显著下降，说明该环境不适宜菌株生长繁殖，细菌在20～35 ℃之间生长相对稳定，这与王倩倩对红酵母菌（Rhodotorula sp.）的研究结果相似（王倩倩，2008）；在强酸性（pH=4）与强碱性（pH=10）环境下，4种细菌OD600值显著下降，其中细菌HS-01、YB-03、JY-04在pH=6时OD600值已显著下降，生长繁殖受到极强的抑制作用，所以细菌的pH适宜范围应为6.5～8。综上得出，HS-01、JH-02、JY-04的最适温度为30 ℃，最适pH为8，YB-03则为35 ℃与7.5。

2.5生物吸附特性研究

研究结果如表2所示，随着重金属离子质量浓度的升高，4种细菌对重金属离子吸附量也逐渐升高，但吸附量增长率却逐渐降低。这可能与菌体吸附位点饱和度有关，当重金属离子质量浓度较高时，只有部分离子能够与吸附位点作用，且高质量浓度的重金属离子对菌体的吸附结构也有影响（周薇，2009；陈月芳等，2013）。当Cd2+、Cu2+、Pb2+复合质量浓度分别达到40、200、200 mg·L-1时，此时细菌仍能继续吸附重金属离子，但菌体吸附位点已逐渐趋近于饱和。细菌HS-01、JH-02、YB-03、JY-04对Cd2+、Cu2+、Pb2+最大吸附量分别达到了2.25、2.05、2.28、2.25 mg，8.19、4.95、8.53、11.78 mg和10.84、10.59、7.66、9.02 mg，同等条件下普遍高于其他相关研究结果（王倩倩，2008；周薇，2009；刘丽，2010；Fan等，2011）。除Cu2+质量浓度达到200 mg·L-1时，细菌JH-02与YB-03对Cu2+的吸附量低于质量浓度为50、100 mg·L-1之外，其余各组吸附量均随着重金属质量浓度上升而增大，出现这种情况可能是因为当Cu2+质量浓度较高时（200 mg·L-1），超过了细菌JH-02与YB-03对Cu2+的耐受范围，此时Cu2+已对这2种细菌产生了一定程度的毒害效应，从而导致2种细菌活体数量以及菌体活性大幅下降，进而影响其对Cu2+的吸附量。

表2 细菌吸附量Table 2 Adsorption amounts of bacteria mg

由细菌吸附率计算结果得出（图5），在Cd2+（10、20 mg·L-1）、Cu2+（50、100 mg·L-1）、Pb2+（50、100 mg·L-1）质量浓度较低时，4种细菌都表现出较好的吸附效率，其中细菌HS-01、JH-02、YB-03、JY-04对Cd2+、Cu2+、Pb2+最大吸附率分别达到了94.4、99.2、100、93.3%，86.1、90.8、88.6、87.3%和88.9、82.2、81.2、86.7%。在同等条件下均高于其他研究中微生物对单一以及复合重金属离子的吸附率（冯宏等，2013；刘丽，2010；王倩倩，2008；周薇，2009）。随着重金属离子质量浓度的逐渐升高，除了细菌YB-03在Cd2+质量浓度从10 mg·L-1上升至20 mg·L-1以及Cu2+质量浓度从50 mg·L-1上升至100 mg·L-1时，细菌对重金属的吸附率下降不显著外，其余各组中吸附率普遍呈显著下降趋势。而当Cd2+质量浓度上升至40 mg·L-1以及Cu2+质量浓度上升至200 mg·L-1时，细菌YB-03的吸附率显著低于其他各组，这可能是由于当Cd2+质量浓度范围为10～20 mg·L-1以及Cu2+质量浓度范围为50～100 mg·L-1时，细菌YB-03活性较强，但随着

Cd2+质量浓度上升至40 mg·L-1以及Cu2+质量浓度上升至200 mg·L-1时，由于Cd2+、Cu2+生物毒性较强，细菌YB-03活性大幅下降，从而导致其对重金属的吸附率显著下降（P＜0.05）。

图5 复合重金属不同质量浓度下细菌的吸附率Fig.5 Adsorption ratios of bacteria under different combined heavy metals mass concentration

综上得出，4种细菌均具有较好的吸附水体中重金属离子的能力，其中细菌HS-01、YB-03、JY-04吸附Cd2+能力较强，而细菌JY-04对Cu2+以及HS-01、JH-02对Pb2+吸附能力最强。另外，在本次生物吸附研究中，4种细菌HS-01、JH-02、YB-03、JY-04菌液吸光度均值分别为0.781、0.698、1.712、1.644，虽然细菌HS-01、JH-02的菌液吸光度较低，但在不同重金属离子质量浓度下，2种细菌的吸附率与YB-03、JY-04相差不大，如经过进一步富集扩大化培养之后，对重金属离子的吸附潜力可能较大。

3 结论

1）4种分离自清远市电子废弃物拆解区污染土壤的菌株，经分析鉴定菌株HS-01、JH-02、YB-03、JY-04分别为海水芽孢八叠球菌（Sporosarcina aquimarina）、佐吕间湖生芽孢八叠球菌（Sporosarcina saromensis）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）。

2）细菌HS-01与JY-04生长周期相同，在0～8 h为调整期，8～12 h为对数期，12～24 h为稳定期，24～32 h衰亡期；而细菌JH-02与YB-03生长周期相同，在0～4 h为调整期，4～12 h为对数期，12～24 h为稳定期，24～32 h衰亡期。HS-01、JH-02、JY-04的最适温度与pH分别为30 ℃与8，而YB-03则为35 ℃与7.5。

3）在Cd2+、Cu2+、Pb2+质量浓度分别为10、50、50 mg·L-1，20、100、100 mg·L-1与40、200、200 mg·L-13个梯度的复合溶液中，随着重金属离子质量浓度的升高，4种耐受细菌对重金属离子的吸附量逐渐升高，但吸附量增长率以及吸附率却逐渐降低。对Cd2+、Cu2+、Pb2+最大吸附量分别达到了2.25、2.05、2.28、2.25 mg，8.19、4.95、8.53、11.78 mg和10.84、10.59、7.66、9.02 mg。另外，在Cd2+（10、20 mg·L-1）、Cu2+（50、100 mg·L-1）、Pb2+（50、100 mg·L-1）质量浓度较低时，4种细菌都表现出较高的吸附率，对Cd2+、Cu2+、Pb2+最大吸附率分别达到了94.4、99.2、100、93.3%，86.1、90.8、88.6、87.3%和88.9、82.2、81.2、86.7%。4种耐性细菌均显示出了较好的修复复合重金属污染水体的应用潜力，但对于电子废弃物复合重金属污染土壤的修复机理和效率还有待进一步研究。

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Isolation and Identification of Four Tolerance Bacteria and the Preliminary Study for Pollution Remediation of Heavy Metals

CHEN Jialiang1,2, LIU Xiaowen2, ZHANG Yajing2, FANG Xiaohang2*
1. Guangdong Provincial Academy of Environmental Science, Guangzhou 510045, China; 2. South China Institute of Environmental science. MEP, Guangzhou 510655, China

Qing Yuan is one of the biggest electronic wastes dismantling base in China, the production pattern of individual workshop has been going on for more than 20 years. A large number of electronic wastes and treatment residuals were dumped in croplands, ditches and valleys. It made the surrounding soils polluted for a long time by Cd, Cu and Pb. There had lots of researches about the present situation analysis and health risk evaluation for heavy metals contaminated soil surrounding dismantling area. But there still had less reports on the study of bioremediation technologies for the e-waste pollution by combined heavy metals. Four tolerance bacteria was isolated from contaminated soil of e-waste dismantling area of qingyuan by this means of enrichment, domestication and isolation. The tolerance bacteria were identified by analyzed of colony morphology and scanning electron microscope and 16S rDNA technology. Four strains of HS-01, JH-02, YB-03 and JY-04 were respectively Sporosarcina aquimarina, Sporosarcina saromensis, Bacillus megaterium and Bacillus methylotrophicus. The growth characteristic experiments indicated that the bacteria of HS-01 and JY-04 had same growth cycle, the regulatory phase was 0-8 h, 8-12 h was the logarithmic phase, 12-24 h was stable phase and 24-32 h was decline phase; Bacterial JH-02 and YB-03 had same growth cycle, regulatory phase was 0-4 h, 4-12 h was logarithmic phase, 12-24 h was stable phase, and 24-32 h was decline phase. The optimum temperature and pH of HS-01, JH-02 and JY-04 was 30 ℃ and 8, while YB-03 was 35 ℃ and 7.5 respectively. With the increase of mass concentration of heavy metal ions, biosorption experiments showed that the adsorption amounts of four tolerance bacteria to heavy metal ions gradually increased, but the growth ratios of adsorption amounts and adsorption ratios were gradually decreased. The maximum adsorption amounts of four tolerance bacteria to Cd2+, Cu2+, Pb2+were 2.25, 2.05, 2.28, 2.25 mg，8.19, 4.95, 8.53, 11.78 mg and 10.84, 10.59, 7.66, 9.02 mg respectively. And the maximum adsorption ratios were 94.4, 99.2, 100, 93.3%, 86.1, 90.8, 88.6, 87.3% and 88.9, 82.2, 81.2, 86.7% respectively. The bacteria of HS-01, YB-03, JY-04 had better adsorption efficiency to Cd2+, JY-04 was optimal to Cu2+, and HS-01, JH-02 was the best to Pb2+. The above results suggests the potential application of four tolerance bacteria to remediate the polluted solution by combined heavy metals, but the remediation mechanism and efficiency of the e-waste polluted soils by combined heavy metals still need to be further research.

electronic wastes; soils; tolerance bacteria; heavy metal; combined pollution remediation

X172

A

1674-5906（2014）07-1199-06

中央级公益性科研院所基本科研业务专项（206030201-21）

陈佳亮（1987年生），男，硕士，主要从事重金属污染生物修复研究。E-mail：chenjialiang_email@163.com

*通信作者：方晓航，高级工程师，主要从事水土污染环境修复研究。E-mail：fangxiaohang@scies.org

2014-03-20

陈佳亮，刘晓文，张雅静，方晓航. 耐性细菌的分离鉴定及重金属污染修复初步研究[J]. 生态环境学报, 2014, 23(7): 1199-1204.

CHEN Jialiang, LIU Xiaowen, ZHANG Yajing, FANG Xiaohang. Isolation and Identification of Four Tolerance Bacteria and the Preliminary Study for Pollution Remediation of Heavy Metals [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2014, 23(7): 1199-1204.

随着电子信息化产业不断发展与更新换代，电子废弃物污染正在全球范围内不断扩大，大量电子废弃物和处理残渣在拆解区周边露天堆置，导致周边水体、土壤长期受到复合重金属污染，严重威胁到人类生存健康（Wu等，2014；Ni等，2014；张朝阳等，2012）。并且重金属常常会出现复合污染状况，通过水稻进入人类食物链，在电子废弃物拆解区周边人群的血液、胚胎、头发中都能检测到污染物的存在（Zhang等，2012）。汕头市贵屿镇电子拆解区周边河流底泥和土壤中的Cd、Cr、Cu、Pb均超过GB 15618—1995《土壤环境质量标准》二级标准，其中以Cd和Cu污染最为严重（林文杰等，2011）。清远市龙塘、石角地区重金属污染最严重的土壤样品中Cd、Pb、Cu、Zn、Ni和Cr质量分数分别高达338、24011、50073、21224、2624和139 mg·kg-1，其他污染区的重金属含量也达到了对照区的数倍甚至数十倍（袁剑刚等，2013）。近年来，国内外学者已开始重视电子废弃物拆解区周边重金属的污染，但目前针对电子废弃物复合重金属污染生物修复技术的研究却并不多见。而微生物种类繁多，数量极大，分布广泛，繁殖迅速，个体微小，比表面积大，对环境适应能力强，使得生物修复技术具有高效低耗、方便简洁、保持水土等优点，已经引起国内外环境学者的广泛关注（冯宏等，2013；罗巧玉等，2013）。本研究从清远市电子废弃物拆解区周边污染土壤中分离得到4种耐受细菌，在分析其生长特性的基础上，利用4种耐受细菌处理Cd、Cu、Pb复合污染溶液，旨在对利用生

物技术修复电子废弃物拆解区周边重金属污染水体与土壤提供参考和依据。