马氏珠母贝肉酶解产物对SD大鼠生化指标的影响研究

韩丝银，郭 健，纪丽丽，蔡丽双，谷长生，宋文东，*

（1.广东海洋大学食品科技学院，广东湛江524088；2.浙江海洋学院食品与医药学院，浙江舟山316022；3.浙江海洋学院石化与能源工程学院，浙江舟山316022；4.广东海洋大学理学院，广东湛江524088）

马氏珠母贝（Pinctada martensii）又称合浦珍珠贝，是我国南海养殖珍珠的主要贝类之一，马氏珠母贝肉是优质的蛋白质资源，其粗蛋白的含量约为贝肉干重的75%[1]，此外，它还含有生理活性的游离氨基酸，其中牛磺酸含量最高达1.38%，占总量的74%，无机盐含量也十分丰富，尤其是微量元素Zn和Se[2]。大量研究表明，马氏珠母贝肉不但有抗肿瘤、抗疲劳、抗衰老等生理作用，还具有安神定惊、平肝潜阳、清热解毒的功效[3-9]，因此，马氏珠母贝肉具有很高的食用价值和药用价值，其开发利用前景广阔。

随着珍珠养殖业的发展，广东、广西、海南等主要养殖区采珠后马氏珠母贝肉有4000多t，数量相当可观。但目前主要被用于饲料加工及晒成干品出售，利用程度低下，导致经济附加值不高[10]，很少有对其进行深入处理后药用和保健价值的相关报道，因此充分开发利用马氏珠母贝肉功能价值的研究是非常必要的，本实验考察了马氏珠母贝肉的酶解优化条件，并测定了其酶解产物对SD大鼠血清生化指标的影响，探讨了其对肝功能和心血管保护的功效，旨在为资源丰富的马氏珠母贝肉的综合利用及开发相关功能性保健产品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

马氏珠母贝 采自广东省湛江市徐闻县珍珠养殖基地，开壳取贝肉（全脏器），清洗后-18℃冷冻备用；清洁级SD雄性大鼠 共16只，平均体重为（80±5）g，动物许可证号为：SCXK（粤）2011-015，购自广东医学院实验动物中心；实验日粮 SD大鼠饲喂基础日粮（组成及营养水平见表1）；木瓜蛋白酶（酶活为300万U/g） 北京酶制剂有限公司；其他试剂 均为分析纯。

电子天平 余姚铭记称重校验设备有限公司；DS-1高速组织捣碎机 上海标本模型厂制造；TG16-WS台式高速离心机 湖南湘仪实验仪器开发有限公司；精密pH计 上海康仪仪器有限公司；电热恒温水热锅 天津市泰斯特仪器有限公司；EX3600全自动生化分析仪 广州市朗道科技开发有限公司。

表1 基础日粮配方及营养水平（风干基础，%）Table1 Composition and nutrient levels of diets（air-dry basis，%）

1.2 工艺流程

马氏珠母贝肉→解冻→清洗→沥干→搅碎→保温酶解→灭酶→离心→上清液→水解度测定。

取沥干的马氏珠母贝肉用捣碎机打浆，用蒸馏水制成5%的匀浆，然后加入木瓜蛋白酶，调节pH，在特定温度下酶解一定时间。灭酶，离心，取上清液测定水解度。

1.3 马氏珠母贝肉酶解的条件优化

1.3.1 单因素实验设计

1.3.1.1 木瓜蛋白酶用量实验 称取20g的马氏珠母贝肉6份，木瓜蛋白酶在pH 7.0，温度为60℃条件下水浴30m in，考察酶用量（木瓜蛋白酶用量与马氏珠母贝肉原料质量比）分别为0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%对水解度的影响。

1.3.1.2 酶解温度实验 称取20g的马氏珠母贝肉6份，在pH 7.0，酶用量0.6%条件下，温度分别为55、 60、65、70、75、80℃水浴30m in，对马氏珠母贝肉进行酶解。

1.3.1.3 酶解时间实验 称取20g的马氏珠母贝肉6份，在pH 7.0，酶用量为0.6%，温度70℃条件下，分别水浴10、15、20、25、30、35m in，对马氏珠母贝肉进行酶解。

1.3.1.4 酶解pH实验 称取20g的马氏珠母贝肉6份，在酶用量0.6%，温度70℃条件下，pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0水浴30m in，对马氏珠母贝肉进行酶解。

1.3.2 正交实验设计 以马氏珠母贝肉蛋白质水解度为考察指标，首先通过单因素实验考察木瓜蛋白酶用量、温度、pH和时间对马氏珠母贝肉蛋白质水解度的影响，初步确定马氏珠母贝肉酶解条件的范围，然后在单因素实验的基础上，采用L9（34）正交表对酶解条件进行进一步优化，其因素水平安排见表2。

表2 马氏珠母贝肉酶解正交实验因素水平表Table2 Factors and their coded levels used in orthogonal array design

1.4 指标测定

1.4.1 总氮含量的测定 马氏珠母贝中总氮含量采用凯氏定氮法测定[11]。

1.4.2 游离氨基氮的测定 游离氨基氮含量采用茚三酮法测定[12]。

1.4.3 水解度的计算 计算公式如下：

马氏珠母贝肉蛋白质水解度DH（%）=水解液中游离基氮含量（mg/m L）/样品中的总氮含量（mg/m L）×100。

1.5 注射液配制

在配制容器中，依次加入注射用水800m L，生理盐水80m L，马氏珠母贝肉酶解上清液100m L，混匀，用碳酸氢钠溶液调节pH至8.0左右，再加入注射用水定量至1000m L，混匀，过滤两次（先砂滤棒过滤一次，再用孔径为0.65μm微孔滤膜过滤一次），分装于中性玻璃容器中，高压灭菌30m in，在0～4℃温度条件保存。

1.6 注射管理

SD大鼠在相同条件下饲养，实验组8只，对照组8只，自由采食、饮水。一周后，在喂食2h后，实验组的SD大鼠腹腔（0.1m L/10g）注射所配制的注射液，对照组腹腔注入等量生理盐水。连续注射2d，1d两次。

1.7 样品采集与测定

注射实验结束后，禁食24h，然后将所有大鼠麻醉后切开腹部，于腹股动脉抽取血液，3500r/m in离心10min，分离血清，保存于-20℃，采用全自动生化分析仪测定其生化指标。

1.8 数据处理

采用Excel 2003对数据处理，Origin 9.0绘图分析，并采用SPSS 17.0进行配对样本t检验，其结果以平均值±标准偏差的形式表示。

2 结果与分析

2.1 马氏珠母贝肉酶解的单因素实验

2.1.1 木瓜蛋白酶用量对马氏珠母贝肉蛋白质水解度的影响 从图1可以看出，随着酶用量增加，酶解液的水解度呈增加趋势，且在酶用量为0.6%的时候水解度已经接近最大值，若此时增加酶用量，水解度的值也不会显著增加。这是因为当底物浓度一定时，酶的浓度超过一定范围，它的催化速率也不会再上升，而是维持在一个平衡的状态。故选择酶用量为0.6%时最佳。

图1 酶用量对水解度的影响Fig.1 Effect of dosage of enzyme on degree of hydrolysic

2.1.2 温度对马氏珠母贝肉蛋白质水解度的影响 从图2可以看出，反应温度低于70℃时，随着温度的升高，水解度逐渐上升，当温度大于70℃时，随着温度的持续升高，水解度迅速下降。由酶促反应原理可知，当酶在一定温度范围，随着反应温度升高而加快反应速度，但温度超过某一界限后，蛋白质会变性，变性的速度远远大于反应的速度。因此，酶解温度在70℃时，马氏珠母贝肉酶解效果最好。

图2 温度对水解度的影响Fig.2 Effectof temperature on degree of hydrolysic

2.1.3 时间对马氏珠母贝肉蛋白质水解度的影响 从图3可以看出，随着时间的延长，马氏珠母贝肉蛋白质水解度先迅速增大，后趋于稳定，当水解超过30min，马氏珠母贝肉蛋白质水解度变化不大，原因可能是在30m in时木瓜蛋白酶对马氏珠母贝肉蛋白质的水解已经达到了平衡状态，随着时间的延长也不会发生变化，故水解时间为30～35m in区间内时，马氏珠母贝肉酶解效果最好。

图3 时间对水解度的影响Fig.3 Effect of time on degree of hydrolysic

2.1.4 pH对马氏珠母贝肉蛋白质水解度的影响 从图4可以看出，当pH＜8.0的时候，随着pH的增大，水解度都呈显著增大趋势，在pH 8.0时达到最大值，当pH＞8.0时，随着pH升高，水解度逐渐下降；这是因为大部分酶的活力受其环境pH的影响，由于环境体系中酸、碱度的改变，酶的空间结构受到影响，极端情况可以致使酶失活；即酶在一定pH条件下，酶反应具有最大速度，此时酶活力相对最高，高于或者低于此值，反应速度下降。因此选择pH8.0作为木瓜蛋白酶酶解马氏珠母贝肉的最适pH。

图4 pH对水解度的影响Fig.4 Effectof pH on degree of hydrolysic

2.2 酶解马氏珠母贝肉的正交实验

从表3、表4分析可知，对马氏珠母贝肉蛋白质水解度值影响的大小次序为B（温度）＞D（pH）＞A（酶用量）＞C（时间），即温度对马氏珠母贝肉酶解效果影响最大，pH对酶解效果影响次之，酶用量对酶解效果影响较小，时间对酶解效果影响最小。通过各因素综合分析，马氏珠母贝肉酶解最优条件为A2B2C3D2，即酶用量0.6%，温度70℃，时间35m in，pH 8.0，在此条件下，马氏珠母贝肉蛋白质水解度为54.79%。

2.3 马氏珠母贝肉酶解产物对SD大鼠的血清指标的影响

由表5可以看出，马氏珠母贝肉酶解产物处理组使SD大鼠血清中前白蛋白、载脂蛋白A1分别上升了38.07%（p＜0.05）、276%（p＜0.05），谷丙转氨酶、谷草转氨酶、载脂蛋白B、肌酸激酶MB型同工酶、超敏C反应蛋白、葡萄糖、间接胆红素分别下降了44.57%（p＜0.05）、40.4%（p＜0.05）、46.67%（p＜0.05）、42.13%（p＜0.05）、100%（p＜0.05）、36.97%（p＜0.05）、49.49%（p＜0.05）。

表3 马氏珠母贝肉酶解正交实验设计及结果Table3 Orthogonal array design scheme and corresponding results

表4 方差分析表Table4 Analysis of variance

表5 实验组与对照组SD大鼠血清生化指标的比较Table5 The comparison between experimental group and control group of serum biochemical indicators in animal SD rat

给SD大鼠注射马氏珠母贝肉酶解产物，使其血清中的前白蛋白较对照组显著升高（p＜0.05），谷丙转氨酶、谷草转氨酶、超敏C反应蛋白、间接胆红素较对照组显著下降（p＜0.05），而在肝病诊断中，血清前白蛋白（PA）是一项反映肝功能受损情况的早期敏感的指标[13]，肝功能损害程度越严重，血清PA越低[14]。超敏C-反应蛋白（CRP）是一种正时相反应蛋白，它和PA是相对应的[15]，在肝组织受到损伤时，因存在一定的炎症应急激反应，CRP就会增高[16]。转氨酶升高也是反映肝脏损伤的标志之一，在临床上较常见，而在谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）及谷酰转肽酶等肝酶中，ALT与肝脏脂肪聚集关系最为密切[17]。胆红素代谢主要在肝脏进行，新生儿时期胆红素产生过多，会使肝细胞负荷加重、胆红素对肝细胞的直接毒性作用、炎症反应破坏肝细胞[18]而使肝酶异常。因此本研究结果表明马氏珠母贝肉酶解产物能够促进肝功能逐渐恢复正常。

给SD大鼠注射马氏珠母贝肉酶解产物，使其血清中的载脂蛋白A1较对照组显著升高（p＜0.05），超敏C-反应蛋白、载脂蛋白B、肌酸激酶MB型同工酶、葡萄糖较对照组显著下降（p＜0.05），而Ridker等[19]研究认为，高水平的CRP使急性心肌梗死的风险增加3倍，是较敏感的心血管预测因子。国内绝大多数临床资料显示，心肌梗死和脑卒中患者与对照组比较载脂蛋白A1明显降低，载脂蛋白B显著增高。总结国外人群前瞻性研究结果显示，载脂蛋白A1、B在预测ACVD和冠状动脉事件的危险性优于LDLC、TC、TG和HDLC等[20-25]。肌酸激酶同工酶（CK-MB）在心血管疾病中，是诊断心肌梗死的敏感指标[26-27]。急性心肌梗死（AMI）时心肌细胞受损，膜的完整性和通透性改变，使细胞内的大分子逸出，其中CK-MB是逸出最早，上升幅度最大的一种酶[28]，并且肝炎合并心肌损害时也易引起CK-MB相对值升高，严重肝损害或高黄疽时都可能出现CK-MB绝对值升高。而糖尿病是世界公认的冠心病的独立危险因素之一[29]，AM I后血糖升高会导致患者的心机损害加重，病死率明显高于血糖正常组[30]。所以积极有效地控制AM I患者的血糖水平，预防糖尿病的发生，对早期预防和控制并发症，降低患者的病死率有积极作用。因此本研究结果表明马氏珠母贝肉酶解产物能够减少心肌损害，缩小梗死面积，降低心律失常、心力衰竭、心源性休克及死亡病例的发生。

3 结论

本文在单因素实验的基础上通过正交实验设计优化马氏珠母贝肉酶解的工艺条件，结果表明，各因素对马氏珠母贝肉蛋白质水解度影响大小次序是温度＞pH＞酶用量＞时间，同时确定了马氏珠母贝肉酶解的最适工艺条件，即酶用量0.6%，温度70℃，时间35m in，pH8.0。对SD大鼠注射马氏珠母贝肉酶解产物的调配试剂，使血清中前白蛋白、载脂蛋白A1显著上升（p＜0.05），谷丙转氨酶、谷草转氨酶、载脂蛋白B、肌酸激酶MB型同工酶、超敏C反应蛋白、葡萄糖、间接胆红素较对照组显著下降显著下降（p＜0.05），结合相关研究，推测出马氏珠母贝肉酶解产物有保肝、保心血管的功效。因此马氏珠母贝肉酶解液是值得开发的功能性物质。

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